Recomendaciones prácticas para maximizar el uso de columnas en HPLC y UPLC
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- Lucas Plaza Ortiz
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1 Recomendaciones prácticas para maximizar el uso de columnas en HPLC y UPLC Las claves del éxito para análisis por HPLC y/o UPLC: afrontando los problemas cromatográficos Comprobad la configuración de Audio 2015 Waters Corporation 1
2 Recomendaciones prácticas para maximizar el uso de columnas en HPLC y UPLC Las claves del éxito para análisis por HPLC y/o UPLC: afrontando los problemas cromatográficos Olatz Mitxelena Soporte Técnico Comercial División Columnas Elena Chiquero Responsable ventas División Columnas área Madrid A través del chat resolveremos las dudas y cuestiones que vayan surgiendo Waters Corporation 2
3 Desafíos en los laboratorios Realizar análisis cromatográficos y asegurar la exactitud de los resultados cromatográficos a través de un enfoque de garantía de la calidad. Minimizar el tiempo empleado en el diagnóstico de averías o malfuncionamiento. Trabajar com métodos robustos que aporten resultados sólidos, fiables y duraderos Waters Corporation 3
4 Mapa origen malfuncionamiento Tiempo de retención Área Linearidad Resolución Botella- Bomba Autoinyector Columna Detector Fase móvil Factor cola Nº platos Ruido/deriva 2015 Waters Corporation 4
5 Agenda Introducción: la columna Conexiones de columna a sistema cromatográfico Filtros de columna Relleno de columna 2015 Waters Corporation 5
6 Introducción: la columna Filtro salida Filtro entrada Salida conector Entrada conector Relleno: partículas sílica funcionalización C18, Fenil, - Conexiones al sistema - Filtros: particulado proveniente de fase móvil, muestra o precipitados - Relleno: particulado, condiciones de trabajo (ph fase móvil, temperatura, viscosidad y presión), contaminación química, interacción muestra 2015 Waters Corporation 6
7 Conexiones: Posición de la férrula fijada de forma incorrecta N 5sigma = 5025 Factor de cola= 1.31 Posición incorrecta de la férrula N 5sigma = 6959 Factor de cola= 1.17 Posición correcta de la férrula 2015 Waters Corporation 7
8 Férrula reutilizable enroscada manualmente con excesiva fuerza Conexión reusable instalada Correctamente P/N au Férrula buen estado Conexión reusable enrosque forzado au Férrula deformada P/N PSL Minutes 2015 Waters Corporation 8
9 Filtros columnas - Mantienen relleno - Evitan entrada particulado en relleno Tamaño partícula relleno (dp) Porosidad filtro 25, 20, 10 µm 5 µm 10, 5, 4, 3.5, 3 µm 2 µm 2.5, 1.8, 1.7, 1.6 µm 0.2 µm UPLC 2015 Waters Corporation 9
10 Filtros columnas: particulado - Partículas insolubles muestras - Precipitados in-situ - Particulado fases móviles - Contaminación bacteriana, algas, - Precipitados sales tampones fosfato - Restos membrana filtración no adecuada Efecto 1: Sobrepresión Efecto 2: Pérdida Resolución Polisulfona procedente de membrana de filtración en filtro de entrada a columna Crecimiento bacteriano filtro entrada Time = 1 h Injection 627 AU Time = 2.17 d Injection Minutes Waters Corporation 10
11 Particulado: Consejos para la preparación de muestras HPLC/UPLC Verificar la ausencia de partículas visibles tras la dilución de la muestra Filtración sistemática: Filtro 0.2µm/0.45µm compatible con diluyente utilizado Cuidado! Interacciones membrana/muestra Recomendado el uso de filtros en línea antes de la columna. La centrifugación puede ser necesaria para eliminar las micropartículas. Una centrifugación de 4000 a rpm durante 5 a 30 min permite aislar partículas invisibles. Tableta Donepezil diluída según la monografía (muy peligroso) Muestra filtrada con 0.2µm Partículas muy finas: solución turbia(peligroso) Muestra filtrada y centrifugada a rpm Solución transparente (OK) 2015 Waters Corporation 11
12 Particulado muestra: recomendaciones Preparación muestra: filtración membrana adecuada/centrifugación Preparación muestra: Sirocco (precipitación proteínas), Ostro (precipitación proteínas+eliminación fosfolípidos), Sep-Pak, Oasis, DisQuE (Quechers) Microprecipitaciones : componentes muestra insolubles en las condiciones del método Waters Corporation 12
13 Particulado: Botellas Fases Móviles Vidrio borosilicato, proceso fabricación y certificación calidad: fuente contaminación y picos fantasma Filtro botella: especial atención, fuente contaminación bacteriana Particulado: ambiental, sales y crecimiento bacteriano 2015 Waters Corporation 13
14 Contaminación bacteriana: fuente de problemas tanto en UPLC como en HPLC. La contaminación bacteriana es una fuente de obturación de columna UPLC, y también en menor medida en HPLC Cuidado! Con las líneas 100% acuosas: Preparar las fases 100% acuosas cada día. o Nota: Los filtros en línea pueden dejar pasar ciertas bacterias. Limpiar regularmente los filtros 2015 Waters Corporation 14
15 Recomendaciones Fases Móviles particulado Utilizar solventes, tampones y aditivos de alta calidad Solventes orgánicos: Calidad High Grade LC o LC/MS, filtrar una vez abierta Agua : El Agua Milli-Q está filtrada a través de una membrana 0.22 µm, no es necesario volver a filtrarla. Los aditivos compatibles LC/MS (ácido fórmico) no requieren ser filtrados en su preparación. Cambiar las fases acuosas cada día (UPLC) o cada 2 días (HPLC) No transferir los nuevos solventes recién preparados a las botellas que están en uso. Filtración : Membranas compatibles solventes fase móvil: GHP/PVDF HPLC 0.45 µm / UPLC 0.22 µm (<3 µm) 2015 Waters Corporation 15
16 Precauciones a considerar con las Fases Móviles Todas las botellas han de estar cerradas Nunca utilizar Parafilm para cubrir las botellas. o Se puede disolver y crear picos fantasma. Utilizar botellas con una buena calidad de vidrio El vidrio borosilicato para las fases móviles aporta un alto ph. Utilizar material de vidrio limpio (para las botellas y la filtración) No utilizar detergentes 2015 Waters Corporation 16
17 Particulado filtro columna: qué hacer? Prevención Determinar origen, en casos sobrepresión: punto obturación Presiones teóricas: calculadora Acquity/Preparativa Cambio prefiltro columnas UPLC/UHPLC Cambio filtro columnas UPLC Tratamiento solubilización o descontaminación Consulta Waters 2015 Waters Corporation 17
18 Relleno columna Particulado filtro columna aplica al relleno Variabilidad en la fabricación/producción de la columna Contaminación columnas Columna degradada Hidrólisis ligando y disolución sílica: ph uso Degradación por Temperatura Colapso hidrofóbico (efecto reversible) Tiempos de equilibrado/re-equilibrado insuficiente Interacciones secundarias: sílica/analitos Interacciones iónicas Interacciones metálicas 2015 Waters Corporation 18
19 Relleno columna Particulado filtro columna aplica al relleno Variabilidad en la fabricación/producción de la columna Contaminación columnas Columna degradada Hidrólisis ligando y disolución sílica: ph uso Degradación por Temperatura Colapso hidrofóbico (efecto reversible) Tiempos de equilibrado/re-equilibrado insuficiente Interacciones secundarias: sílica/analitos Interacciones iónicas Interacciones metálicas 2015 Waters Corporation 19
20 Relleno columna Particulado filtro columna aplica al relleno Variabilidad en la fabricación/producción de la columna Contaminación columnas Columna degradada Hidrólisis ligando y disolución sílica: ph uso Degradación por Temperatura Colapso hidrofóbico (efecto reversible) Tiempos de equilibrado/re-equilibrado insuficiente Interacciones secundarias: sílica/analitos Interacciones iónicas Interacciones metálicas 2015 Waters Corporation 20
21 Qué hace que una columna LC sea reproducible? A) Sorbentes B) Empaquetado C) Ingeniería µm ACQUITY UPLC BEH C µm XBridge BEH C 18 XP Plate Height (H, 4 sigma) 2.6 µm Core-Shell C Acenaphthene, 2.1 x 50 mm columns 70/30 MeCN/H 2O, 30 C, 254 nm Linear Velocity, u (cm/sec) Todos ellos son CRITICOS! 2015 Waters Corporation 21
22 Aseguramiento reproducibilidad Primary Manufacturer Bonder Column Packer Distributor Particle Creation Bonding Bonding Column Packing Column Packing Column Packing Sales and Distribution Sales and Distribution Sales and Distribution Sales and Distribution Certificación cgmp, ISO 9001 e ISO Registrado FDA 2015 Waters Corporation 22
23 Recomendaciones Columnas Testar 3 lotes diferentes de columna para evaluar la calidad y la fiabilidad del método: Robustez. Tests con kit Method Validation ACQUITY UPLC CSH C x 50 mm Method Validation Kit (P/N ) AU Lot AU Lot AU Lot Minutes Test Acceptance Criteria Ziprasidone Zip-Imp 1 Zip-Imp 2 Zip-Imp 3 Zip-Imp 4 Result Intermediate Precision Ret Time < 2% RSD Peak Area < 5% RSD Pass 2015 Waters Corporation 23
24 Relleno columna Particulado filtro columna aplica al relleno Variabilidad en la fabricación/producción de la columna Contaminación columnas Columna degradada Hidrólisis ligando y disolución sílica: ph uso Degradación por Temperatura Colapso hidrofóbico (efecto reversible) Tiempos de equilibrado/re-equilibrado insuficiente Interacciones secundarias: sílica/analitos Interacciones iónicas Interacciones metálicas 2015 Waters Corporation 24
25 Otras fuentes de contaminación -Particulado -Solventes -Muestra (p.e.proteínas) -Detergentes -Plastificantes -Filtros solvente -Aditivos -Par iónico Preparar y manipular las muestras adecuadamente: Utilizar viales con certificación según detector y aplicación: Vial selector Filter Selector Waters Corporation 25
26 Uso de precolumnas (guarda-columnas) para aumentar la vida de las columnas Muestra alimentaria con celulosa vegetal, sílice y estearato de magnesio, disuelta en 50/50 Agua/Acetonitrilo 2015 Waters Corporation 26
27 Precauciones con las precolumnas: Ratio volumen precolumna/columna (1:25 1:10) Imprescindible la misma química que la columna para reducir el riesgo de cambios de selectividad 2015 Waters Corporation 27
28 NUEVAS! Precolumnas VanGuard Nuevo formato de precolumnas para HPLC: Conexión directa a columna para minimizar volúmenes muertos o Disponibles dos formatos según férrula de entrada de columna Alto rendimiento de empaquetado para mantener la separación Disponibles en todos los tamaños de partícula (2.5µm a 5µm) XBridge, XSelect, Atlantis, SunFire, XTerra, Symmetry 2015 Waters Corporation 28
29 Contaminación relleno columna: qué hacer? Prevención Determinar origen Cambio prefiltro columnas UPLC/UHPLC Cambio filtro columnas UPLC Uso precolumnas o guardacolumnas Tratamiento solubilización o descontaminación: manuales columnas Consulta Waters 2015 Waters Corporation 29
30 Relleno columna Particulado filtro columna aplica al relleno Variabilidad en la fabricación/producción de la columna Contaminación columnas Columna degradada Hidrólisis ligando y disolución sílica: ph uso Degradación por Temperatura Colapso hidrofóbico (efecto reversible) Tiempos de equilibrado/re-equilibrado insuficiente Interacciones secundarias: sílica/analitos Interacciones iónicas Interacciones metálicas 2015 Waters Corporation 30
31 Degradación de relleno: ph Grupos funcionales (C18) ph<2 hidrólisis ácida Sílica convencional ph>7 se disuelve Funcionalización y End-capping ph<1 (XBridge) Sílica híbrida ph>12 (XBridge) 2015 Waters Corporation 31
32 Degradación de relleno: Temperatura - Disminuye viscosidad fase móvil - Parámetro crítico: azúcares, aminoácidos - Herramienta desarrollo métodos (ajuste fino) - Herramienta regeneración columna - Acelera procesos degradación (cuidado ph + T) Tmax = 80 ºC Tmax bajo ph= 80 ºC Tmax alto ph= 60 ºC ACQUITY TUV ChA - ACQUITY TUV ChA 260nm AU ACQUITY TUV ChA - ACQUITY TUV ChA 260nm AU Minutes 2015 Waters Corporation 32
33 Test acelerado estabilidad rellenos 2015 Waters Corporation 33
34 Colapso Hidrofóbico: De qué se trata? Al trabajar con una fase móvil altamente acuosa con columnas muy hidrófobas, pueden darse cambios repentinos de V0 así como de tiempo de retención. Esto es indicativo de que los poros expulsan la fase móvil y se secan, perdiendo capacidad de retención. *1 10% de reducción en el volumen muerto 23% de pérdida de retención del analito ACQUITY UPLC BEH C 18 L = 5 cm F = 0.3 ml/min P = 2,040 T = 90 o C % Dewet = V o Shift -Atlantis T3 -XSelect HSS T3 -XBridge BEH Shield RP Minutes 1.25 *1 T.H. Walter, P. Iraneta and M. Capparella J. Chromatogr. A 1075 (2005) Waters Corporation 34
35 Relleno columna Particulado filtro columna aplica al relleno Variabilidad en la fabricación/producción de la columna Contaminación columnas Columna degradada Hidrólisis ligando y disolución sílica: ph uso Degradación por Temperatura Colapso hidrofóbico (efecto reversible) Tiempos de equilibrado/re-equilibrado insuficiente Interacciones secundarias: sílica/analitos Interacciones iónicas Interacciones metálicas 2015 Waters Corporation 35
36 Tiempos de equilibrado ID Length Volume 5X Vol Flow Rate EQUILIBRATION TIME mm mm ml ml ml/min ACQUITY 0.60mL 0.35mL 0.15mL Nota: Optimización posible experimentalmente. Re-equilibrado gradientes: 5-8 volúmenes columna HILIC, ciertos aditivos requieren mayor tiempo equilibrado/reequilibrado 2015 Waters Corporation 36
37 Relleno columna Particulado filtro columna aplica al relleno Variabilidad en la fabricación/producción de la columna Contaminación columnas Columna degradada Hidrólisis ligando y disolución sílica: ph uso Degradación por Temperatura Colapso hidrofóbico (efecto reversible) Tiempos de equilibrado/re-equilibrado insuficiente Interacciones secundarias: sílica/analitos Interacciones iónicas Interacciones metálicas 2015 Waters Corporation 37
38 Interacciones secundarias Procesos síntesis sílica, funcionalización y End-capping actuales optimizados para minimizar estos efectos 2015 Waters Corporation 38
39 Recomendación relleno: Viales QCRM Comprobación rápida rendimiento SISTEMA + COLUMNA: Específicamente formulado para proporcionar una evaluación rápida y fácil del sistema en ciertas condiciones de fase reversa Componentes del vial con las siguientes características: Separados adecuadamente por fase reversa Buena absorbancia a 254nm Separación para amplia gama de condiciones Referencia QCRM Neutros: Waters Corporation 39
40 Diagnóstico del sistema a través de los QCRM EN 2015 Waters Corporation 40
41 QCRMs disponibles : Standard Part Number Neutrals Reversed-Phase LCMS Quad LCMS QDa Preparative Dye Standard HILIC SEC SEC SEC IEX Cation IEX Anion Waters Corporation 41
42 Oferta especial Webinar 30% descuento 2015 Waters Corporation 42
43 Preguntas 2015 Waters Corporation 43
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