CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN. HPLC High Performance Liquid Chromatograpy

Transcripción

1 CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC High Performance Liquid Chromatograpy

2 Comparación HPLC y CG Volatilidad de la muestra HPLC ola volatilidad no es necesaria ola muestras deben ser solubles en la fase móvil CG ola muestra debe ser volátil obajo PM

3 Cromatografía líquida C.L.S. adsorción C:L:L: Reparto

4 Fase Normal Fase Estacionaria polar Fase Móvil no polar a lo polar incremento de la fuerza eluotrópica

5 Fase Reversa FE no polar FM polar a lo no polar incremento de la fuerza eluotrópica

6 Hidrófilo Aminoácidos Iones inorgánicos Ácidos carboxílicos volátiles Sulfonamidas Cetonas de aldehídos Glifosatos Glicoles Colorantes alimentarios sintéticos PG, OG, DG fenoles Enzimas Aflatoxinas Alcoholes de azúcares Azúcares Polaridad Nitrosamina TMS derivado de azúcares Nitrilos Pesticidas organofósforos BHT (butilhidroxitolueno), BHA (butilhidroxianisol), THBO antioxidantes PCB Alcohol Aminas aromáticas PAHs Ácidos grasos Anabólicos Antibióticos Flavonoides Colorantes alim. naturales Vitaminas solubles en grasas Epóxidos Aceites esenciales Monómeros de polímero Triglicéridos Fosfolípidos Hidrófobo C2/C5 hidrocarburos Metiléster ácidos grasos Ésteres aromáticos Volátil Volatilidad No volátil 6

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8 HPLC Isocrático Solvente Bomba Inyector Columna Detector Registrador Electrometro

9 Solventes Pureza Grado HPLC Filtración Poro de 0.45 micras Nylon Teflón Desgacificación

10 Bombas Se requiere de una bomba que de una presión alta para forzar al líquido a pasar por la columna a una velocidad satisfactoria. Debe mantener el flujo constante durante períodos relativamente largos.

11 Las Bombas de Pistón dual

12 INJECTORES

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16 Columnas acero inoxidable (soportan presiones hasta 5000 psi) Diámetro de 1 a 6 mm Longitud de 10 a 30 cm El soportes para la fase líquida tierra de diatomeas, zipax o corasil

17 Columnas de HPLC Fase móvil desde la bomba Muestreador Precolumna Las columnas varían en los siguientes aspectos: Longitud Diámetro interno Material de la fase estacionaria Tamaño de partícula de la fase estacionaria Actúa sobre la muestra para atrapar partículas y componentes de muestras retenidos con fuerza. Al detector Columna analítica La columna analítica lleva a cabo la separación. 17

18 Columna - Acero inoxidable estándar Relleno de columna Capilar Frita de filtro de acero inoxidable Tamaño de poro de 2 um 18

19 Materiales de relleno de columnas - Sílice Esférico Irregular Soles de sílice Xerogeles Las partículas tienen un diámetro de 3 a 10 μm en las columnas estándar. 19

20 Materiales de relleno de columnas - Fases enlazadas Poros Cadena de carbono con forma de cepillo H 3 C Si CH 3 Fase enlazada monomérica O OH R 1 R 1 Si Si Si-OH + Cl-Si-R Si-O-Si-R + HCl O O O R2 R2 20

21 Materiales de relleno de columnas - Fases enlazadas extensamente utilizadas HPLC de fase inversa C18 C8 C4 C1 Fenilo Las columnas de HPLC más utilizadas Separaciones de proteínas Dipolo débil - dipolo inducido Interacciones con analitos polares HPLC de fase normal o inversa CN NH 2 Polaridad intermedia HPLC de fase normal Diol Separaciones de compuestos con polaridades muy diferentes Intercambio iónico CH 3-0-Si- R CH 3 DEAE (dietilaminoetanol) QAE (aminoetilo cuaternario) Carboximetilo Exclusión de tamaño Glicerilpropilo 21

22 Número aproximado de platos (N) y volumen vacío (Vm) para columnas de 5 mm y 3,5 mm Si se reducen simultáneamente la longitud de la columna (N ) y el tamaño de partícula (N ), se podrá: Mantener la resolución Reducir el tiempo de análisis Reducir el uso de disolventes Tamaño de la Número de platos Volumen vacío Tamaño de partícula columna (N) (V m ) 4,6 x 250 mm 5- m m ,5 ml 4,6 x 150 mm 5- m m ,5 ml 4,6 x 150 mm 3.5- m m Resolución rápida ,5 ml 4,6 x 75 mm 3.5- m m Resolución rápida ,75 ml 4,6 x 50 mm 3.5- m m Resolución rápida ,5 ml 4,6 x 30 mm 3.5- m m Resolución rápida ,3 ml 4,6 x 15 mm 3.5- m m Resolución rápida ,15 ml 22

23 Presión mau bar 0 Conseguir todo el potencial con mayor velocidad de flujo Rs 2,1 = 2,2 Rs 7,6 = 2,2 Flujo 2 ml/min mau bar 0 3 ml/min mau bar 0 0 Rs 2,1 = 2,1 Rs 7,6 = 2,2 30 seg 0,1 0,2 0,3 0,4 0, ,9 min 4 ml/min Zorbax SB-C18, 3,5 µm, 4,6 x 30 mm 23

24 Velocidades de flujo típicas d.i. de columna Flujo partículas de 5 mm ) ml/mi 4,6 1 n 2 3,0 0,4-0,8 2,1 0,2 0,4 1,0 0,05 0,09 24

25 Adsorbance Absorbancia SB-C18 4,6 x 15 mm Longitud de columna - Adaptar la longitud a la resolución deseada los 7 componentes se descomponen en menos de 1 min DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,4 4,6 x 30 mm Condiciones: LC: Hewlett-Packard HP1100 Columnas: Zorbax SB-C18, 3,5 µm Fase móvil: 1 mm octano ácido sulfónico, Na sal, ph 2,5: ACN (80:20) DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,4 UV: 275 nm; flujo: 2,0 ml / min.; 70 C Vol. de inyección: 1 µl 4,6 x 50 mm Muestra: 1. Acetoaminofeno (4-acetoamidofenol) 2. Cafeína 3. 2-Ac2-Acetoamidofenol 4. Acetanilida 5. Aspirina (ácido acetilsalicílico) DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,4 6. Ácido salicílico 7. Fenacetina (acetofenetidina) 4,6 x 75 mm DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,4 4,6 x 150 mm DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360, min 25

26 Operación de un gradiente en HPLC

27 Definición de Gradiente El cambio de composición en la fase móvil durante una corrida cromatográfica

28 . El principal motivo de un gradiente de elución es el de mover los compuestos retenidos fuertemente de una manera rápida, pero tomando en cuenta que el último compuesto debe ser resuelto debidamente

29 Tipico gradiente

30 Estrategias para desarrollar un gradiente Lograr la máxima separación Decrecer el tiempo de reequilibrio Reducir el ciclo de inyección

31 Uso de gradientes cortos Uso de flujos altos Uso de columnas cortas o rocket Uso de tamaño pequeño de partícula Incremento de la temperatura

32 Ecuación de Resolución R ( 1/ 4) N x ( 1) x k' 1 k' Eficiencia Selectividad Capacidad

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35 El tipo de elución es mantenido durante toda la corrida, haciendo los ciclos mas cortos

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37 Cambios en La composición de la FM La composición de la FE ph Temperatura de la columna Aditivos en la FM

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39 Cambios en k Cambiar la composición de la FM Incrementando la Fza de la FM decrece la k En una C18, el incremento de la polaridad en la FM hace que los solutos sean retenidos más fuertemente

40 Cambios en k Bajando la polaridad de la FM disminuyendo la cantidad de agua causa que las moléculas de la muestra eluyan más rápidamente

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44 Detectores Visible UV Arreglo de diodos Índice de refracción Fluorescencia Electroquímico

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46 Características del detector ideal Bajo nivel de ruido Alta sensibilidad Respuesta rápida Respuesta lineal alta Bajo volumen muerto Insensible al cambio del tipo de solvente Operación simple y reproducible De preferencia no destructivo

47 Fracción del espectro electromagnético infrared (IR) 2,500-50,000 nm near infrared 800-2,500 nm visible nm ultraviolet (UV) nm

48 Ley de Lamber Beer UV variable

49 UV variable Muchos solutos absorben Lecturas entre a 3 ua Lineraridad de 5 ordenes de magnitud Eluciones por gradiente con solventes que no absorben

50 Arreglo de Diodos

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53 Arreglo de Diodos Registra el espectro de cada soluto conforme eluye de la columna Permite seleccionar mejor la longitud de onda, importante cuando no hay información disponible sobre las absortividades molares Pureza. La forma del pico, la absorbancia a varias longitudes de onda es particularmente útil decidiendo si la cresta representa un solo compuesto o, es una cresta compuesta..

54 Índice de Refracción Único detector universal en HPLC La detección es la medida en el cambio del índice de refracción del eluyente pasando a través de la celda. No permite eluciones por gradiente

55 Índice de Refracción

56 Detector de Fluorescencia 15 % de los compuestos Alifaticos ciclicos, con grupos carbonilo, dobles enlaces conjugados Compuestos aromáticos no sustituidos, entre mas anillos mas F.

57 Detector de Fluorescencia

58 Detector Electroquímico Selectivo, solo ciertos analitos se oxidan o se reducen con facilidad Oxidación: fenoles, aminas aromáticas, peróxidos y mercaptanos Reducción: cetonas, aldehídos, nitrilos conjugados, halógenos aromáticos y comp. nitro aromáticos

59 Detector Electroquímico

60 Ruido