Por que se considera una técnica confirmatoria?
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- Cristóbal Prado Miranda
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1 Espectrometría de masas Por que se considera una técnica confirmatoria? Espectrometría de masas Técnicas de ionización Ionización electrónica Ionización química Bombardeo de átomos y espectrometría de masas iónica Ionización a presión atmosférica Electroespray Desorción de matriz asistida por láser Analizador de masas Cuadrupolo Sector magnético Tiempo de vuelo Trampa de iones Sector eléctrico (c/doble foco) Que hace un espectrómetro de masas? Método instrumental destructivo Método analítico altamente sensible (pg/ml fg/ml) Es una balanza a nivel nanomolecular Ioniza, separa y detecta los iones producidos
2 Ionización electrónica Útil para moléculas en fase gaseosa Produce espectros reproducibles comparables incluso con librerías de espectros Los espectros entregan información estructural, para interpretación de espectros desconocidos. En algunas ocasiones el ion molecular es de muy baja abundancia. Se produce una doble proceso: ionización y fragmentación La nube de electrones generadas es acelerada por un campo eléctrico. El impacto del analito con esta nube remueve un electrón de la capa mas externa del analito produciendo el catión radical (M +. ) Ionización electrónica La energía aplicada (70eV) es lo suficientemente alta para producir la ionización y fragmentación. Solo se necesitan 10 ev para la ionización y 3 ev por cada enlace químico. Sistema que funciona a un alto vacío ( torr)
3 Ionización química Técnica de ionización suave, produce iones con poco exceso de energía, por lo tanto con poca fragmentación. Es una técnica complementaria a la IE, utilizada principalmente para verificar la masa molecular de un compuesto desconocido. Se utiliza un gas de reacción de bajo peso moleclar para generar la ionización del analito (metano, isobutano, amoníaco) el cual previamente es ionizado por una nube de electrones (200 ev). El gas de reacción ionizado donara un protón al analito y generara un ion MH +. Se pueden producir moléculas con carga + ó dependiendo del gas utilizado. Ionización química IE del gas de reacción para formar iones: CH 4 + e - CH e - reacción de los iones del gas para formas aductos: CH CH 4 CH. 3 + CH + 5 Ó CH +. 4 CH H. CH CH 4 C 2 H H 2 reacción de los iones del gas con moléculas del analito CH M CH 4 + MH + C 2 H M C 2 H 4 + MH +
4 Bombardeo atómico y espectrometría de masa iónica Ambas utilizan átomos de alta energía para bombardear e ionizar la muestra en un único paso (Cs + ). Es útil para muestras liquidas o sólidas de alta peso molecular (analitos termolábiles con peso molecular hasta Da). El analito que se encuentra en una matriz líquida o sólida es introducida a la fuente mediante una sonda y bombardeada (glicerol, alcohol nitrobenzilico, trietanolamina, polietilenglicoles). Bombardeo atómico y espectrometría de masa iónica Electroespray Se utiliza en analitos de alto peso molecular y termo lábiles y/o no volátiles (péptidos, proteínas y polímeros), moléculas de hasta 230 kda. También es útil en analitos de bajo PM (MS/MS) La mas utilizada fuente de iones en la CL/EM La muestra en forma iónica es convertida en un aerosol y sometida a un alto voltaje dentro de una cámara a P atm Al introducir un líquido a un sistema de baja presión este tiende a congelarse, por lo cual disminuiría la sensibilidad de la técnica. Para evaporar el solvente acuoso se utiliza un gas (N 2 ).
5 Electroespray La ionización se produce por una aplicación de un gran potencial entre la salida de la aguja y el paso hacia el analizador. La teoría mas aceptada en la actualidad para explicar este proceso es que el liquido al salir de la aguja entra en un campo eléctrico, que induce la formación de cargas en la gota. Al evaporarse el solvente la gota se contrae y la densidad de carga en la superficie aumenta. La gota alcanza un punto en que la repulsión de cargas es mayor a la tensión superficial y la gota explota produciendo iones con diferente carga (explosión Coulombica ). Electroespray La información que entrega es acerca de su PM, solo se obtienen datos cuando se acopla a un sistema MS/MS. Desventajas: efecto matriz: puede provocar ionizaciones no deseadas, afectando la abundancia relativa de los iones. Formación de aductos con componentes de la fase móvil (Na +, K +, NH 4 + ) aumenta los m/z de los fragmentos producidos. Una pequeña energía adicional es impartida a los iones en la fuente ESI y por lo tanto la fragmentación que se produce es mínima Electroespray
6 Ionización química a presión atmosférica Similar a la técnica de electrospray, pero con menor rango de masas ( Da). Se crea un plasma en una aguja de descarga, en este plasma se transfiere un H + al analito y se fragmenta. Tiene menos efecto de matriz que la ESI. Ionización química a presión atmosférica
7 Desorción de matriz asistida por láser Se utiliza principalmente para grandes moléculas (polímeros, péptidos, proteínas, etc.) hasta 200 kda. Esta técnica ioniza y vaporiza el analito directamente desde una fase condensada. Un único pulso de láser (N 2 λ=337 nm) produce la desorción del analito desde la matriz y posterior ionización. La matriz debe ser capaz de absorber el láser a la longitud de onda a la cual este se emite. El analito junto a la matriz escogida de colocan en la punta de una sonda y se introducen en un sistema al vacío, para ser bombardeada por un láser. Desorción de matriz asistida por láser Analizadores de masas Resolución: capacidad de separación de 2 iones, donde R= m/m. Rango de masas: es el valor de m/z mas alto transmitido por el espectrómetro. Velocidad de barrido: es la velocidad con que se barre un espectro de masas. Debe ser en teoría mas rápido que la elución de los analitos desde la columna. Eficiencia de la transmisión: cuantos de los iones producidos en la fuente llegan al detector. Limite de detección: capacidad de detectar la menor cantidad de analito con precisión y exactitud.
8 Cuadrupolo Es el mas utilizado, de tamaño compacto, rápida velocidad de barrido, alta eficiencia de transmisión, poco requerimiento de vacío 10-3 a 10-5 torr) Resolución de una unidad m/z. Rango de masas: 1000 m/z El analizador consta de 4 barras o electrodos que filtran los iones de acuerdo a su relación m/z. El valor filtrado es determinado por la RF y el voltaje de la corriente directa aplicado a los electrodos. Cuadrupolo El movimiento de iones dependerá de la aplicación de los campos electromagnéticos y eléctricos aplicados a = 8zU / mr 2 ω 2 q = 4zV / mr 2 ω 2 a/q = 2U/V= cte m/z = 8U/ar 2 ω 2 m/z = 4V / qr 2 ω 2 m/z = ku o k V
9 Sector magnético Son los de mayor resolución ( m/z) Amplio rango de masas (5000 m/z m/z) Velocidad de barrido menor que un cuadrupolo Necesitan un alto vacío para trabajar Los instrumentos de sector magnético separan los iones dentro de un sector magnético por su momentum y carga iónica. Los iones son acelerados al igual que otros analizadores por campos eléctricos, pero en este caso de mucho mayor intensidad (1-10 kv). El campo magnético es capaz de curvar la trayectoria de la nube de iones dependiendo del momentum del ion (µ). Sector magnético Cada valor de m/z tendrá su respectivo r, que será único para el campo magnético y el voltaje de aceleración dado (r = µ/ C B) C = z e y µ = m v r = (m/z v)/(b e) m/z = (r 2 B 2 e)/2v Para detectar iones a diferentes radios los equipos actuales utilizan arreglos de diodos de multicanal para detectar simultáneamente iones en un amplio rango de valores m/z. Sector magnético
10 Otra forma utilizada para medir los valores m/z es mantener constante el potencial eléctrico aplicado y el radio por el cual viajan los iones y variar el rango de B para que los iones con valores m/z cercanos alcancen el valor apropiado de r. En este caso el detector utilizado es un electromultiplicador Manteniendo cte los valores de B y r, y variar el potencial V aplicado, se tienen problemas con la estabilidad y la velocidad de escaneo de analizador. Espectrómetro de masas de doble enfoque / sector eléctrico Consiste en dos platos curvos concéntricos, a los cuales se aplica un voltaje que curva la nube iónica. El radio de la trayectoria depende de la energía cinética del ion y del potencial aplicado (r = 2V/E). El radio es independiente de m/z, por lo cual un sector eléctrico no es útil como un analizador de masas independiente. Se acopla a un sector magnético, mejorando la resolución del sistema, por la reducción en la distribución de la energía cinética de los iones. Espectrómetro de masas de doble enfoque / sector eléctrico
11 Tiempo de vuelo Es capaz de separar los iones generados en el tiempo mientras ellos viajen en un tubo de vuelo (2m). Es un espectrómetro simple que no requiere campos magnéticos y trabaja a un voltaje fijo. Tienen una baja resolución menor a 500. Alta eficiencia en la transmisión Rápida velocidad de barrido Alto limite de rango de masas (500 kda). Bajos límites de detección Tiempo de vuelo Los iones son acelerados por campos eléctricos de alta intensidad (2-25 kv), aplicados entre el plato de apoyo y la grilla de aceleración. Como todos los iones son acelerados en la misma distancia, por la misma fuerza, todos tendrán la misma energía cinética. E C = ½ mv 2 por lo cual los iones mas ligeros viajaran mas rápido. La Ep es determinada por el voltaje aplicado y la carga del ion v = (2V e)/(m/z) t= (L/ (2V e)) m/z Tiempo de vuelo
12 Trampa de iones Alta sensibilidad Bajo costo Rápida velocidad de escaneo Alta relación señal-ruido La trampa de iones consta de un electrodo circular con forma de rosca y 2 electrodos en los extremos. Una combinación de RF y voltajes es aplicado a los electrodos para crear un campo electromagnético semejante al de un cuadrupolo. Los iones con cierta energía potencial son atrapados en el centro de la trampa.
13 Triple cuadrupolo Por que utilizar técnicas MS/MS? Mayor Selectividad Paso de aislación Paso de disociación Menores límites de detección Solo permanecen en la trampa los iones que necesito Mejor calidad de los espectros Reducción del ruido Menor limpieza de las muestras Información estructural complementaria Ionización del analito (IE o IQ) Aislación del ion padre semejante a un SIM Pasos en un proceso MS/MS Disociación del ion padre disociación inducida por colisión (CID)-colisión con átomos de H el usuario determina experimentalmente la energía de colisión Análisis masa de los iones hijos igual proceso que un SCAN
14 Colisión inducida por disociación en trampa iónica El gas de colisión siempre es el gas transportador (He) Las ondas aplicadas (resonante o no-resonante) a los electrodos de los extremos desplazan los iones almacenados desde el centro de la trampa hacia los extremos (campo eléctrico). El oscilamiento de los iones entre los extremos permite su colisión con los átomos de He. Cuando las colisiones alcanzan un nivel energético suficiente la disociación ocurre y se forman los iones hijos. DIC modo no resonante Es una onda cuadrada de 500 Hz que es aplicada a los electrodos extremos. La amplitud varia entre 0 y 100 V. Los iones almacenados se mueven hacia los electrodos cargados negativamente. La energía de colisiones con el He es controlada por la amplitud de la onda. DIC modo resonante Es una onda de alta frecuencia (~ 20 KHz) aplicada a los electrodos extremos. Se necesitan menores voltajes (< 1.0 V) Es mas selectiva que la onda no resonante. Solo el ion padre en resonancia con la onda aplicada es excitado y disociado.
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