Titulo del estudio: Determinación estructural de un analito en baja resolución en Ionización Química (IQ)

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1 RIAIDT Rede de Infraestruturas de Apoio á Investigación e ao Desenvolvemento Tecnolóxico Vicerrectorado de investigación Titulo del estudio: Determinación estructural de un analito en baja resolución en Ionización Química (IQ) Conceptos clave: Equipo Magnético, Geometría trisector (EBE), Ionización química (IQ), sonda sólidos, masa monoisotópica, masa promedia. Test realizado por: Unidade de Masas e Proteómica

2 TABLA DE CONTENIDOS PÁGINA 1. INTRODUCCIÓN: Espectrometría de masas OBJETIVO MATERIALES, MÉTODOS Conceptos: Masa promedio y monoisotópica Ionización Química Condiciones de la muestra Instrumentación RESULTADOS Determinación de espectros moleculares Conceptos clave STATEMENT OF OWNERSHIP /8

3 1. INTRODUCCIÓN: ESPECTROMETRÍA DE MASAS La Espectrometría de Masas es una técnica microanalítica que requiere solamente unos pocos nanomoles de muestra para obtener información característica de la estructura e de la masa molecular del compuesto a estudiar. Es una técnica destructiva en la que la muestra es consumida durante el análisis. En todas las técnicas usadas en espectrometría de masas, alguna forma de energía es transferida a la molécula dando lugar la ionización de la misma. En la mayoría de los casos, el ion molecular (Ion resultante de la ionización de la molécula que representa a la misma y que es la precursora de todos los fragmentos que componen el espectro de masas) de la muestra explota en una variedad de fragmentos (Patrón de Fragmentación). Los productos que se forman son iones en fase gas en los que sus masas y abundancias relativas constituyen el espectro de masas. Dependiendo del tipo de analizador empleado, la espectrometría de masas puede realizarse en baja o en alta resolución. Con analizadores como el cuadrupolo o la trampa de iones se trabaja en baja resolución, y con analizadores magnéticos o TOF se trabaja en alta resolución. En analizadores de alta resolución, podemos separar mucho mejor los picos. La resolución viene definida por: Donde R es la Resolución y AM Es el poder resolutivo Cuanta mayor resolución nos de un analizador, mejor separación de picos espectrales. De esta forma se puede emplear esta alta resolución para realizar medidas de masa exacta, enfrentando el valor teórico del analito en cuestión con la medida experimental realizada con el espectrómetro de masas. Existen diferentes modos de ionización en Espectrometría de masas, que se utilizan en función del tipo de muestra y polaridad. Entre los más importantes y recurridos tenemos: Impacto Electrónico (EI), Ionización Química (CI), FAB ( Fast Atom Bombardment) o L-SIMS (Liquid-Secondary Ions Mass Spectrometry), MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption ), ESI Electrospray), APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization). Con estas técnicas de ionización en el espectrómetro de masas y con acoplamientos a cromatografía de Gases o Líquidos, se pueden realizar diferentes tipos de análisis: - Análisis cualitativo - Análisis cuantitativo - Elucidación estructural - Determinación de masa exacta - Estudios de fragmentación selectiva por MS/MS El análisis por espectrometría de masas se emplea en muestras que estén en estado sólido o líquido. Dependiendo de la técnica a emplear y las características del analito a medir, se emplea un sistema de introducción de líquidos o sólidos determinado. 3/8

4 2. OBJETIVO El objetivo de este estudio es realizar una determinación estructural por Ionización Química (IQ) utilizando un equipo magnético con fuente de ionización IQ. El espectro de masas nos daría información estructural de la molécula a medir. Con esta técnica, que es más blanda que Impacto Electrónico, podríamos conseguir un espectro del ion molecular intacto con menos fragmentación que el conseguido en IE. Puede ser interesante en los casos en los que el ion molecular no se aprecia por Impacto. 3. MATERIALES, METODOS 3.1 Conceptos: Masa promedio y monoisotópica. Masa Promedio: Es aquella que se puede obtener en base al carbono 12. El C12 se usa como patrón de la masa atómica de los distintos nucleídos que existen en la naturaleza, dado que la masa atómica del 12C es por definición 12 umas (Unidades de Masa atómica). Basándonos en este concepto, masa promedio es la suma de la media química de las masas de sus componentes considerando su abundancia. Masa Monoisotópica: La masa monoisotópica es la suma de las masas monoisotópicas de cada elemento del analito. Es la que se emplea cuando se hacen medidas en alta resolución. 3.2 Ionización química (CI = Chemical Ionisation) La técnica de Impacto Electrónico es una técnica muy agresiva, ya que provoca mucha fragmentación del ion molecular, dándonos mucha información estructural y muy poca (o ninguna) información molecular. Esto conlleva la dificultad de interpretar el espectro. En los casos que interesa tener más información del ion molecular y menos de la fragmentación es mejor recurrir a otras técnicas de ionización menos agresivas como es el caso de Ionización Química (Técnica de ionización blanda.- llamada así, debido al poco exceso de energía que es depositada en las moléculas cuando son ionizadas). La Ionización Química se realiza mediante la reacción de las moléculas neutras de muestra problema con iones procedentes de la previa ionización (por impacto electrónico) de un gas reactivo. En el caso de usar metano como gas reactivo, estos iones son: CH 5 + (m/z 17); C 2 H 5 + (m/z 29); C 2 H 3 + (m/z 27); C 3 H 5 + (m/z 41). Las reacciones que tienen lugar entre los iones reactivos cargados positivamente y las moléculas de muestra pueden ser agrupadas principalmente en 4 categorías: Transferencia protónica, Intercambio de carga, Adición electrofílica y Abstracción aniónica. Por ejemplo los iones CH 5 + e C 2 H 5 + formados a partir del metano reaccionan con moléculas de la muestra por transferencia protónica: M + C 2 H MH + + C 2 H 4 + 4/8

5 3.3 Condiciones de la muestra para Ionización Química Condiciones de almacenaje: dependiendo del tipo de muestra puede almacenarse a temperatura ambiente, en la nevera (4-7 C), o en congelador (-20 C), protegidas con viales suministrados por el solicitante. Cuidados de manipulación: Con muestras líquidas se emplea campana de extracción, guantes de látex, gafas de protección. En el caso de sólidos, mascarilla de protección contra polvo. Tipo de muestra para ionización química: Es la técnica usada como alternativa al Impacto Electrónico para visualizar el ion molecular. Se emplea en análisis de compuestos orgánicos relativamente lábiles, como en productos farmacéuticos, metabolitos, esteroides, carbohidratos, lípidos, pesticidas, etc. 3.4 Instrumentación El equipo magnético de alta resolución utilizado es el modelo AUTOSPEC de la casa comercial Micromass (Actualmente Waters). Las características de este equipo son: Geometría trisector EBE patentada por Micromass y que proporciona un instrumento compacto, con alta sensibilidad y alta resolución, libre de metastables en espectros normales y barridos enlazados libres de artefactos. El rango de masas es variable dependiendo de la técnica de ionización empleada. El voltaje de aceleración es de 8 kv. Posibilidad de ionizar muestras por las técnicas de impacto electrónico, ionización química y L-SIMS. Sonda de introducción directa para la medida de muestras sólidas y líquidas, con la posibilidad de calentar hasta 650ºC, con control tanto automático como manual por el operador. Reservorio de referencia para estándares conocidos. Cañón de cesio de 35kv para realización de L-SIMS líquido. Sonda para medidas exactas usando compuestos de referencias externos. 5/8

6 4. RESULTADOS 4.1 Determinación de espectros moleculares Comparativa de un analito medido en Impacto electrónico y en Ionización Química, donde se observa el ion molecular protonado (M+H+) más claramente en Ionización Química. Dependiendo de la presión en el gas seleccionado (Metano, en este caso) se puede conseguir más o menos fragmentación. 6/8

7 C 17 H 24 O 3 Exact Mass: Mol. Wt.: O O CH 3 CH 3 H 2 C O Espectro de masas en Ionización química de baja resolución. El pico que en este caso buscaríamos es el H+ (por la presencia del gas metano, siempre sale protonada la masa) que tiene una intensidad relativa del 10%. 7/8

8 4.3 Conceptos Clave Masa monoisotópica: La masa monoisotópica es la suma de las masas monoisotópicas de cada elemento del analito. La precisión de masa es un porcentaje de la masa medida y se mide tanto en tanto por ciento como en partes por millón. Relación masa/carga (m/z), es la relación del número de masa (m) de una partícula dada entre el número (z) de unidades cargadas electrostáticamente que posee la partícula. Así, m/z es una relación adimensional que es el parámetro medido por el analizador de masas. Definición de ion molecular o progenitor y de pico base. El ion molecular resulta de la ionización de la molécula a analizar. Este ion representa la molécula intacta y es el último precursor de todos los iones fragmentados que componen el espectro de masas. El pico del ion molecular aparece a un valor m/z numéricamente igual al peso molecular del compuesto. El pico base es el pico más intenso en el espectro de masas. Es usado como base para normalizar las intensidades de los otros picos. Al pico base se le asigna una intensidad relativa de 100%(en el caso de que la muestra que se analiza sea pura) Gas reactivo. El método de la IQ implica la mezcla de la muestra (aproximadamente 10-4 Torr) con un gas reactivo en alta presión (1 Torr) en la fuente de ionización de los iones. Los gases reactivos, comúnmente usados, son: metano, Isobutano y amonio. 5. STATEMENT OF OWNERSHIP Este informe contiene un estudio realizado por Unidad de Masas en la Universidad de Santiago de Compostela, en nombre del sponsor MMMMM. Todos los resultados e interpretaciones son propiedad del patrocinador. Bajo ninguna circunstancia se mencionara a cualquier dato sin conocimiento del patrocinador. Las muestras serán devueltas al propietario. 8/8