MASS ESPECTROMETRY DR. SERGIO ALEMANO. Como procesar el material vegetal? Identificación y cuantificación de fitohormonas // -UNRC

Transcripción

1 MASS ESPECTRMETRY R. SERGI ALEMAN Como procesar el material vegetal? Identificación y cuantificación de fitohormonas // -UNRC 2 1

2 LFV UNRC 2013 Cromatografía 3 Separación basada en polaridad Historia de la cromatografía líquida Cromatografía de fase reversa La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase inmóvil apolar y una fase móvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de cromatografía es la silica tratada con RMe2SiCl, dónde la R es una cadena alquil tal como C18H37 ó C8H17. El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar, mientras que las moléculas de carácter polar efluyen más rápidamente. Identificación y cuantificación I 4 2

3 LFV UNRC 201 LFV UNRC 2013 Separación basada en polaridad Historia de la cromatografía líquida Los gradientes usualmente comienzan con una fase móvil predominantemente acuosa y gradualmente avanza a una fase orgánica. La fase reversa, separa sobre la base de hidrofobicidad, con correlaciones con el número de carbones de los compuestos. C H 3 6 Carbonos 7 Carbonos H 3 C 8 Carbonos C H 3 Fuente: Chem 7116 Quantitation Module Lecture 2 Techniques & Equipment for Small Molecule Quantitation Identificación y cuantificación I 5 Sensibilidad HPLC Partículas pequeñas, incrementan la sensibilidad y reduce tiempos de la corrida. Estándar: 5 µm, pero < 3 µm, mejor. iámetro de la columna: SAME INJECTIN VLUME Capilar 1mm I column 2mm I column 4.6mm I column Fuente: Chem 7116 Quantitation Module Lecture 2 Techniques & Equipment for Small Molecule Quantitation Identificación y cuantificación I 6 3

4 LFV UNRC Identificación y cuantificación I 7 Como detectar hormonas vegetales? Identificación y cuantificación hormonas // LFV-UNRC 8 4

5 Identificación y cuantificación de fitohormonas / / LFV-UNRC ETECTRES HPLC etector de absorbancia (UV-Visible) 10 5

6 11 La Espectrometría de Masas es una poderosa técnica micro-analítica usada para: Identificar compuestos desconocidos. Cuantificar compuestos conocidos Elucidar la estructura y propiedades químicas de moléculas. Para compuestos no volátiles, iones de la molécula intacta son producidos al pasar la solución por un campo eléctrico (electrospray ionization) o por bombardeo de partículas (fast atom bombardment) (Villa, 2003). 12 6

7 Identificación y cuantificación de fitohormonas / / LFV-UNRC Identificación y cuantificación de fitohormonas / / LFV-UNRC How does a mass spectrometer work? Fuente de Ionización ESI, API. Cuadripolos Placa de coalición Ionización Separación de iones etección de iones 13 Consideraciones Espectrometría de Masas MS/MS La finalidad de la ionización es que la muestra M pierda un electrón, generando así un ion radical M+. (porque ahora tiene un electrón desapareado) ó gane uno M -. Como los iones son inestables y muy reactivos se deben manipular en alto vacío Al detector llegarán todos los iones, tanto el M+. Como los fragmentos de éste. El detector registra todos los iones según su relación m/z (relación masa/carga) y los cuantifica según su abundancia relativa. (como generalmente se forman iones con una sola carga m/z se trata simplemente de la masa del ion). Pico base: ion mas abundante del espectro (100 % abundancia relativa) 14 7

8 Identificación y cuantificación de fitohormonas / / LFV-UNRC INIZACIÓN APCI: Carbamatos Herbicidas: Fenilurea Pesticidas Triglicéridos Aditivos en pláticos Explosivos Micotoxinas Fármacos Antioxidantes Azúcares Ácido Succínico Compuestos Fenólicos Ejemplos de Aplicación José Rodríguez Servicio Instrumentación Científica (SUIC). Universidad de Murcia API-Electrospray: Sulfonilureas Hidratos de Carbono LS Benzodiazepinas Morfinas Pesticidas Pigmentos Micotoxinas Péptidos y proteínas Fármacos Salbutamol Penicilina Aminas Aromáticas / Cuaternarias Antidepresivos Esteroides y corticoesteroides Antocianinas Iones 15 Fuente de Ionización ESI, API. Ionización Ionización 16 8

9 Identificación y cuantificación de fitohormonas / / LFV-UNRC Ionización Electrospray (ESI): es una muy fina pulverización, donde se generá un campo magnético, y se utiliza en aquellas moléculas que tienen polaridad, y se debe tener en cuenta que el solvente ya es polar. Electrospray ionization (ESI) y que llevó a John B. Fenn a compartir con el Ing. Tanaka el Premio Nobel de Química Se trata del método de volatilización / ionización de analitos más suave que se conoce a tal punto, que se ha demostrado que material viral sometido a este método de ioniza-ción mantiene intacta su actividad, Erra-Balsells, Espectrometría de Masas LC- MS / MS 18 9

10 Identificación y cuantificación de fitohormonas / / LFV-UNRC How does a mass spectrometer work? Fuente de Ionización ESI, API. Cuadripolos Placa de coalición Ionización Separación de iones etección de iones 19 Espectrometría de Masas GC- MS / MS Analizadores Cuadrupolos Trampa de iones Tiempo de vuelo 10

11 Identificación y cuantificación de fitohormonas / / LFV-UNRC Espectrometría de Masas MS/MS A principios de los 50 s, los patrones de fragmentación de los iones comenzaron a ser entendidos, aunque los aparatos disponibles estaban limitados en el rango de masas. tro tipo de instrumento desarrollado para el propósito de acoplar el espectrómetro de masas a un cromatógrafo de gases fue el filtro de masas cuadrupolo, el cual usa un campo eléctrico cuadrupolar conteniendo componentes de radiofrecuencia y corriente directa para separar iones. En 1953 el analizador de masas cuadrupolo fue patentado por Wolfgang Paul de la Universidad de Bonn. En 1956 las primeras muestras biológicas (esteroides) fueron exitosamente analizadas Espectrometría de Masas LC- MS / MS 11

12 Identificación y cuantificación de fitohormonas / / LFV-UNRC Identificación y cuantificación de fitohormonas / / LFV-UNRC How does a mass spectrometer work? Fuente de Ionización ESI, API. Cuadripolos Placa de coalición Ionización Separación de iones etección de iones 23 Placa de coalición etector etección de iones primary ion V + e - L e - e - e V L >> 24 12

13 25 Espectrometría de Masas LC- MS / MS Cuales son las variables a tener en cuenta en un LC-MS/MS? Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC 26 13

14 27 Cuales son las formas de identificar y cuantificar compuestos en un LC- MS/MS? Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC 28 14

15 Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC Mass analyzers separate ions based on their mass-to-charge ratio (m/z) aughter: Selecciona una masa en el primer cuadripolo, y luego realiza un scan en el segundo con el fin de determinar fragmentos provenientes de esta masa luego de pasar por la zona de colisión del LC-MS-MS 29 Pico Base Fragmentos? Ion Molecular 30 15

16 Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC Mass analyzers separate ions based on their mass-to-charge ratio (m/z) Multiple reaction monitoring (MRM) aughters of ABA 263 m/z 111 m/z 153 m/z 263 m/z 31 MASS SPECTRMETRY ABA AUGHTERS The Plant Journal Volume 35, Issue 3, pages , 8 JUL 2003 I: /j X x 16

17 Multiple reaction monitoring (MRM) Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC 33 17

18 Como realizar una curva de calibración en un LC-MS/MS? Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC 35 Cuantificación Fuente: Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC 36 18

19 Cuantificación Además, cuando se utiliza una técnica de purificación previa al cromatógrafo asumo que el rendimiento de este proceso es exacto. Fuente: Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC 37 Cuantificación Ventajas: - Se independiza de la precisión del volumen de inyección, principalmente para HPLC ó GC que no poseen inyección automatizada. - Se independiza de la repetitividad del proceso de purificación. Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC 38 19

20 Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC P A - M e C C 3 Cuantificación Estandarés, deuterados, carbonados, etc., de Jasmonatos P A P C - 8 P C - 8 C H C H C H C H J A CC3 CH CC3 CH 11-H-JA CCH3 12-H-JA CH 3CC CH CAs 4 isomers CH Ac- -Ketol H C H C H S2H CC3 12-HS4-JA CH S2H C C 3 J A - M e Fuente: r. tto Miersch. Leibniz-IBP, Halle. Germany 39 Cuantificación Estandarés, deuterados, carbonados, etc., de Jasmonatos Fuente: 40 20

21 Administrator: Fill out blue racks or letters Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC LC-MS/MS Compound: JA 209 > 59 MW: 210 Standard: (6)JA 215 > 59 Mixtures: Calculation for: JA ng Compound / Area Compound / Area Area y = 1,6766x - 0,0627 a = 1,6766 Area Standard Area standard JA (6)JA ( y = ax + b ) b = -0, , ,3 0, ,6 1, Compound: JA 1 1, Area 6,3 ng/sample 2 3, (6)JA 1 Area standard 30,2 pmol / sample 3 5, JA 1 Area standard 5 7, Weigth Compound: JA 7,5 12, Standard [ng] 10 31,7 ng / g 10 17, Sample [mg] ,9 pmol / g Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC Area Compound / Area Standard) 18,00 16,00 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00-2,00 Compound - Standard y = 1,6766x - 0, ng Compound / ng Standard Cuantificación 41 Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC Cuantificación 42 21