ANÁLISIS CUALITATIVO vs. CUANTITATIVO
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- María Isabel Cortés Espejo
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1 ANÁLISIS CUALITATIVO vs. CUANTITATIVO 1. CUALITATIVO - qué está presente? Cromatografía - compare t R 's Espectroscopía - MS, IR, UV 2. CUANTITATIVO - Cuánto está presente? Altura de pico Área de pico HPLC 6 10/96 1
2 ANÁLISIS CUALITATIVO Teofilina Teobromina 1. Estándar Cafeína "X" 2. Desconocido t R(theophylline) =t R( X ), entonces, se sugiere que X es teofilina. Para confirmación positiva, se debe emplear LC-MS HPLC 6 10/96 2
3 ESPECTROMETRÍA DE MASAS / LC Efluente LC Espectrómetro de masas Solvente Muestra Sistema de datos Al Vacío Muestra concentrada Espectro de masas HPLC 5 10/96 34 HPLC 6 10/96 3
4 EXACTITUD-META ANALÍTICA Error absoluto: Diferencia entre valor medido y el valor verdadero. Error relativo (%) : (Error / Valor Verdadero) x 100 = % Error Ejemplo: Peso verdadero 50.0 g Peso medido 48.0 g Error absoluto 2.0 g % Error ( 2 / 50 ) x 100 = 4 % HPLC 6 10/96 4
5 PRECISIÓN 1. Mide reproducibilidad 2. Depende de la técnica HPLC 6 10/96 5
6 MEDIDA DE LA PRECISIÓN: DESVIACIÓN ESTÁNDAR S.D. x x n 1 Desviación estándar relativa = RSD S.D. x Chemist X Chemist Y Data Statistics Data Statistics 10.0 n = n = x = x = = = RSD = 15.8% 10.1 RSD = 4.8% HPLC 6 10/96 6
7 COMPONENTES DE EXACTITUD CALIBRACIÓN + PRECISIÓN = EXACTITUD 1. Esencial calibración con estándares 2. Precisión (reproducibilidad) necesaria para un procedimiento analítico exacto HPLC 6 10/96 7
8 PROCESO CUANTITATIVO HPLC 1. Muestreo 4. Integración 2. Preparación de la muestra 5. Cálculos 3. Cromatografía HPLC 6 10/96 8
9 MUESTREO 1. Objetivo tomar una pequeña muestra representativa de una población grande 2. Problemas Contaminación La muestra no es representativa HPLC 6 10/96 9
10 PREPARACIÓN DE MUESTRA 1. Procedimiento Moler Disolver Filtrar Extraer Diluir Concentrar Derivatizar 2. Problemas Pérdida de muestra Contaminación HPLC 6 10/96 10
11 CROMATOGRAFÍA Registrador Bomba Inyector Medidor de presión Reservorio de solventes Sistema de datos o integrador Columna Detector Macintosh Desecho HPLC 6 10/96 11
12 CONVERSIÓN DIGITAL ALTURA DE PICO B C D A h h h HPLC 6 10/96 12
13 INTEGRACIÓN ÁREA DE PICO Area Más difícil que medir altura de pico, pero está menos influenciado por cambios en la temperatura de la columna o el flujo. HPLC 6 10/96 13
14 INTEGRADOR DIGITAL ELECTRÓNICO DETECTOR A / D CONVERTIDOR MICROPROCESADOR IMPRESORA sjhd kahd kjhd kjhd kjhd kjhsd kjhsd kjhs kjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs aljd lkjsd lkjsd lkjsd lkjs dljad ljadlj sljd aljd lkjsd iou fijgf oujfjd iuzdshda, adh fiehkjhd audddehfjsiu dsj.jfldu oejalkjd lkjs dlkj djs REGISTRADOR CINTA HPLC 6 10/96 14
15 SISTEMAS DE DATOS INTEGRADOR. Fácil de usar. Precio moderado COMPUTADORA. Flexible/poderosa. Más caras HPLC 6 10/96 15
16 VENTAJAS DE LOS INTEGRADORES 1. Sensibilidad 2. Intervalo dinámico 3. Exactitud/precisión 4. Corrección de línea base 5. Identificación de pico (Computadora) 6. Automatización total (Computadora) Programación de temperatura Integra, cuantifica Auto-calibra Introducción de la muestra Registro impreso Regeneración de la columna Repetición del programa HPLC 6 10/96 16
17 LIMITACIONES DE INTEGRADORES 1. Costo de capital 2. Se requiere entrenamiento 3. Picos no resueltos - baja exactitud 4. Sobreconfianza HPLC 6 10/96 17
18 CÁLCULOS: NORMALIZACIÓN DE ÁREA SIMPLE Área = 150 B A 300 C Cálculos wgt %A Area A Total Area % 2. Procedimiento usualmente no válido Asume que todos los picos responden igual Asume que la suma de áreas es el 100% de la muestra HPLC 6 10/96 18
19 CÁLCULOS: FACTOR DE RESPUESTA B C A Peso = 10 g 10 g 10 g Área = Los factores de respuesta difieren HPLC 6 10/96 19
20 CÁLCULOS DEL FACTOR DE RESPUESTA Área (Cuentas) 300 C B A A W FR Cuentas de área [ g] B. 30 A. 15 C Peso ( g) HPLC 6 10/96 20
21 CÁLCULOS: NORMALIZACIÓN CON CORRECCIÓN DE ÁREA Area RF Corrected Area A B C wgt %A = (10/30) x 100 = 33.3% HPLC 6 10/96 21
22 CÁLCULOS: ESTÁNDAR EXTERNO Área Desconocido Peso ( g) 1. Desarrolla una curva de calibración con estándares, y compara con el desconocido 2. Requiere de una inyección reproducible 3. Es más empleado en LC que en GC HPLC 6 10/96 22
23 SELECCIÓN DEL ESTÁNDAR INTERNO Muestra sola Muestra + ISTD Requisitos: 1. Estándar puro 2 Picos bien resueltos 3. Nunca presente en la muestra 4. En el mismo nivel de concentración HPLC 6 10/96 23
24 CÁLCULOS: ESTÁNDAR INTERNO (1) IS = EST. INTERNO A = ANALITO A A IS IS IS A Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Área A / Área IS Muestra 3 Muestra 2 Muestra 1 Peso A / Peso IS 1. Prepare e inyecte muestras de estándar interno y del analito de interés. 2. Prepare una curva de calibración de los datos cromatográficos, graficando la relación de áreas contra la relación de pesos de analito y estándar interno. HPLC 6 10/96 24
25 CÁLCULOS: ESTÁNDAR INTERNO (2) Área A / Área IS Desconocido X Peso A / Peso IS 1. Añada con precisión el IS a la muestra desconocida 2. Cromatografíe la mezcla 3. Calcule la relación de áreas 4. Determine la relación de pesos de la curva de calibración 5. Encuentre el peso del analito HPLC 6 10/96 25
26 ANÁLISIS CUANTITATIVO HPLC Component True Weight % Measured Weight % Relative Error (%) Et Paraben Pr Paraben Bu Paraben HPLC 6 10/96 26
b. No debe reaccionar con ninguno de los componentes de la mezcla.
ANÁLISIS CUALITATIVO Una vez obtenido un cromatograma satisfactorio se procede a realizar la identificación de los componentes de la muestra empleando alguna de las siguientes técnicas. 1. Técnica cualitativa
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