INTRODUCIÓN A LA METODOLOGÍA DEL LABORATORIO

Transcripción

1 INTRODUCIÓN A LA METODOLOGÍA DEL LABORATORIO Un equipo de laboratorio es un conjunto de instrumentos con funciones específicas, útiles para desarrollar un trabajo de diagnóstico o investigación. Estos instrumentos presentan diferentes aplicaciones según el campo de conocimiento en el que se involucren y el propósito que se les asigne, sin embargo su funcionamiento y los resultados directos que de ellos se obtienen dependen de unos principios básicos de acción. La elección del equipo de laboratorio debe tomar en consideración los reglamentos nacionales y las instalaciones técnicas que determinan los requisitos para su uso apropiado; cuanto mas completo sea un instrumento mas dependerá el usuario del apoyo de un proveedor para el mantenimiento, por ello es pertinente prever la magnitud de los gastos que puedan estar implicados en su uso. Todo equipo de laboratorio debe incluir un manual de funcionamiento, en el que se describa la aplicación, la instalación y el empleo del mismo, el cual debe ser leído por el usuario antes de su adquisición. Es importante tener en cuenta que el costo de adaptación de un equipo (suministro apropiado de energía) puede aumentar o superar considerablemente el precio efectivo de compra del mismo. EQUIPOS DE LABORATORIO Y TÉCNICAS Para Para Para Purificación de Calefacción. Agua. Seguridad Biológica. Para Separación Para Análisis. Desionizador Destilador Horno Baño María Incubadora Cámara de Flujo (Clase I, II y III ) Centrífuga Electroforesis Cromatografía SISTEMA PARA PURIFICACIÓN DEL AGUA El agua pura es indispensable para muchos procedimientos dependiendo de la aplicación para la que se requiera. Esta purificación es un procedimiento costoso, por consiguiente, antes de adquirir e instalar una unidad de purificación, es preciso definir el nivel de pureza requerido para evitar gastos excesivos e innecesarios en la producción de agua demasiado pura. Existen dos técnicas principales de purificación del agua: Desionización (Desmineralización) Destilación.

2 DESIONIZACIÓN Consiste en la eliminación de Iones inorgánicos presentes en el agua mediante el uso de resinas absorbentes de iones. Pueden utilizarse con relativa facilidad y no requieren aporte energético, pero no eliminan impurezas orgánicas, es decir que no producen agua estéril, siendo vulnerable a la contaminación bacteriana, particularmente en un medio caluroso. Los Desionizadores contienen resinas insolubles de intercambio catiónico (RES SO3H) y de intercambio Aniónico (RES CH2N (CH3)3OH + ). Estas resinas pueden conservarse en columnas separadas o en una columna de lecho mixto. El agua corriente pasa a través de las columnas de resina, que intercambian los electrolitos solutos por iones H + y OH -. Las resinas de intercambio catiónico están cargadas negativamente para captar iones cargados positivamente (Cationes) y las resinas de intercambio Aniónico están cargadas positivamente para captar los iones cargados negativamente (Aniones). Las resinas deben regenerarse o sustituirse, de acuerdo a las recomendaciones del fabricante cuando la conductividad del agua de salida es superior a 20 µs/cm, por lo tanto deben revisarse con regularidad para tener la seguridad de que no están saturadas y de que producen el suficiente nivel de pureza requerido. Este examen se realiza midiendo la conductividad eléctrica del agua tratada. La conductividad eléctrica es la propiedad que tienen las sales inorgánicas en solución (electrolitos) para conducir la corriente eléctrica, es decir, el agua pura prácticamente no conduce la corriente eléctrica mientras que el agua con sales disueltas la conduce muy bien (agua de mar). Los iones cargados positivamente o negativamente son los que la conducen la corriente y la cantidad conducida depende del número de iones presentes y de su movilidad. Unidades de conductividad Eléctrica: Siemens/cm µs/cm (Microsiemens/cm) Es importante anotar que entre mas caliente esté el agua, mayor será la conductividad, por eso se mide de manera estándar a 25 o C. La regeneración o sustitución de las resinas depende de la cantidad de agua tratada y de su dureza ( la dureza guarda relación con el contenido de calcio en el agua). La dureza del agua tratada por un desionizador es prácticamente nula. El flujo de agua que pasa por los desionizadores debe ser constante para evitar la formación de colonias de bacterias y hongos. El empleo de agua clorada puede intoxicar la resina del desionizador produciendo su fallo prematuro.

3 DESTILACIÓN Es un proceso mediante el cual se elimina la materia orgánica no volátil y toda la materia inorgánica. El agua destilada puede producirse mediante equipos sencillos de destilación o equipos a gran escala, dependiendo la cantidad de agua requerida y su calidad. El agua contaminada se evapora a una temperatura superior a los 100 o C en una cámara cerrada; el vapor supera la presión atmosférica y las condiciones entonces, son óptimas para la esterilización, ya que las bacterias no sobreviven en tales condiciones; sin embargo no se produce agua completamente estéril porque pueden existir esporas que soportan los 100 o C, por lo tanto es necesario, una vez enfriado y condensado este vapor, colectar el agua en un recipiente para obtener agua destilada. El proceso requiere de una estrecha supervisión a menos que esté dotado de dispositivos automáticos de seguridad. La destilación no es práctica en el caso de agua con alta concentración de sales o de agua muy dura. En estos casos puede ser conveniente la desionización por intercambio iónico antes de la purificación por destilación. El agua destilada y desionizada puede contaminarse de nuevo fácilmente con materias orgánicas e inorgánicas que pueden pasar del recipiente al agua, por lo tanto no deben utilizarse recipientes de vidrio o de metal pues iones como los de Sílice, Hierro y Plomo pueden pasar al agua, por lo tanto se recomiendan recipientes limpios de Polietileno o Polipropileno (plásticos). EQUIPOS PARA CALEFACCIÓN Son Instrumentos que calientan el agua o el aire creando un ambiente artificial de temperatura controlado. Horno (Estufas) Consiste en un sistema cerrado para producir aire caliente, seco o húmedo a elevadas temperaturas, principalmente útil para secar equipo de laboratorio o esterilizar material. Todo horno debe incluir un termostato para mantener la temperatura requerida y un termómetro para verificar la misma. Es importante recordar que la esterilización (si el horno se usa con este fin) comienza cuando el aire de la estufa ha alcanzado la temperatura requerida. También hay que tener en cuenta que algunas de las esporas pueden sobrevivir y que endotoxinas bacterianas pueden sufrir solo una inactivación parcial, por lo tanto este equipo no es recomendado para esterilización completa.

4 Baño María Es un sistema controlado de calentamiento de agua que permite mantener una temperatura constante dentro de una gama reducida (± 0,1 o C ) en el curso de un proceso de investigación. Alcanza una temperatura máxima de 100 o C y es muy útil para calentar o descongelar rápidamente soluciones que se inactivan fácilmente ante el calor directo. El nivel del agua en el baño debe mantenerse por encima del nivel de la solución que se ha de incubar. Los recipientes, viales o tubos abiertos, deben incubarse en el baño maría manteniendo la tapa para evitar la contaminación y dilución del material incubado por el agua de condensación. El agua de los Baños Maria debe cambiarse con regularidad para evitar la proliferación de algas y bacterias. Incubadoras Se utilizan principalmente para mantener cultivos bacterianos o de células y tejidos en condiciones reguladas de temperatura, humedad y nivel de gases (especialmente CO2). La temperatura de las incubadoras debe controlarse diariamente, limpiarse con regularidad (por lo menos cada 14 días) e inmediatamente después de que se derrame cualquier producto infeccioso. EQUIPOS PARA SEGURIDAD BIOLÓGICA Dado que los aerosoles son importantes fuentes de infección, ha de cuidarse de reducir la amplitud de su formación y dispersión. Incluso cuando se emplea un equipo seguro es preferible efectuar estas operaciones en cámaras de seguridad biológica o cámaras de flujo laminar. Estos aparatos constituyen el principal elemento de contención física en el laboratorio, ya que actúan como barrera para evitar el riesgo de infecciones transmitidas por el aire al impedir la salida de aerosoles a la atmósfera del laboratorio y por consiguiente evitan su inhalación por el personal. Así mismo protege las muestras contra la contaminación aérea y del manipulador. Estos equipos se utilizan cuando se realizan procedimientos con posibilidad de producir aerosoles con riesgo de infección transmitida por el aire, cuando se manejan químicos o reactivos con concentraciones elevadas o altamente volátiles, cuando se trabaja con muestras que deben mantenerse bajo condiciones de esterilidad. Existen tres tipos de cámaras de seguridad biológica: Clase I Clase II Clase III La eficiencia de estas cámaras depende del sistema de ventilación, de la capacidad de contención (barrera), de la integridad de los filtros de aire y de la localización de las mismos respecto a corrientes de ventilación y movimiento de personal.

5 Cámaras Clase I o Flujo Laminar Horizontal Es una cámara de manipulación abierta por delante, ventilada con una corriente de aire sin recircular dirigida hacia adentro para alejar las partículas del operador. Esta equipada con filtros HEPA para proteger la atmósfera contra la salida de microorganismos, por lo tanto, estas cámaras protegen al operador pero no al material que se halla dentro de la cámara. Las cámaras Clase I se pueden utilizar con microorganismos de riesgo bajo o moderado. Cámaras Clase II o Flujo Laminar Vertical Es una cámara abierta por delante con una corriente de aire que circula hacia adentro y el paso del aire de entrada y del aire de salida es a través de un filtro HEPA. Esta cámara protege tanto al operador como al producto y al medio ambiente. Existen dos variaciones principales: Clase IIA Clase IIB Clase IIA Clase IIB Recirculación del 70% del aire Puede utilizarse con microorganismos de riesgo bajo o moderado o con sustancias químicas poco tóxicas. Recirculación del 30% del aire Son apropiadas para mayores cantidades de sustancias tóxicas, volátiles o radioactivas. Cámara Clase III Es una estructura completamente cerrada y ventilada, impermeable a los gases y mantenida bajo presión negativa. Esta cámara recibe aire a través de un filtro HEPA y se evacua a través de dos filtros del mismo tipo montados en serie. Las manipulaciones se efectúan utilizando guantes de goma cuya manga recubre todo el brazo. Estas cámaras son útiles para trabajo con microorganismos de alto riesgo ya que proporcionan una barrera total entre el operador y el trabajo. EQUIPOS DE SEPARACIÓN CENTRÍFUGA Es un aparato que aplica una fuerza centrífuga constante para impeler la materia hacia fuera del centro de rotación. Este principio se utiliza para separa partículas en un medio líquido por sedimentación. La base física de la separación es la acción de la fuerza centrífuga sobre las partículas en rotación, que aumenta con el radio de l campo rotacional y con la velocidad de rotación.

6 La velocidad de sedimentación depende de la densidad de las partículas, es así que las mas densas se sedimentan primero, seguidas de las menos densas y las muy ligeras pueden incluso permanecer en suspensión. Es de importancia decisiva el equilibrio de la carga de la centrifugadora en todo momento; cuando hay que centrifugar un número impar de muestras se debe incluir un tubo con un volumen apropiado de agua que nivele el peso. Durante el proceso de centrifugación deben estar tapadas las muestras biológicas. Si se produce un ruido anormal debe detenerse inmediatamente porque indica que no está equilibrada correctamente. Además no se debe utilizar nunca una centrífuga con tapa abierta. CENTRIFUGACIÓN Es un método que utiliza la propiedad de sedimentación de partículas con base en su masa para la separación de las mismas en una solución. La fuerza centrífuga es aplicad a cada partícula de la solución (muestra) la cual será sedimentada en un índice que es proporcional a la fuerza aplicada y al peso molecular, densidad y forma de las macromoléculas. Centrifugación Zonal: una muestra en solución contiene partículas que pueden ser separadas en capas o zonas (zonal) en una columna de gradiente de densidad elaborado. El gradiente de densidad es un solvente que presenta una única densidad. Dependiendo de la densidad del solvente la muestra puede ubicarse directamente sobre él y tras la centrifugación los de rápida sedimentación se ubicarán en la parte inferior y los de baja sedimentación en la parte superior. Por ejemplo, como se observa con Ficoll-Hypaque y sangre total. La densidad de los leucocitos es igual a la del Ficoll, por eso éstos se ubican sobre él (cada partícula sedimenta sólo en la posición en la cual su densidad es igual a la del gradiente). Otro gradiente muy usado es el de sacarosa, el cual es poco viscoso y polar. La muestra se distribuye en el fluido y sólo se consigue la separación tras la centrifugación donde los componentes con alta densidad se van al fondo y los de baja densidad se orientan hacia la superficie. Centrifugación en Gradiente de Densidad: o centrifugación de equilibrio, permite que las partículas a sedimentar se muevan por un gradiente de diferentes densidades, hasta que alcancen un punto donde su densidad y la del gradiente son idénticas. Esta técnica se emplea para separar partículas similares en tamaño pero diferentes en densidad, por ejemplo para separar organelos celulares. Se utiliza por ejemplo cloruro de cesio, sulfato de cesio y el percoll, entre otros. Una vez se han separado las diferentes especies moleculares u organelos en un gradiente de densidad, es importante recuperar los componentes de manera independiente. Esto se puede realizar de forma ascendente utilizando una

7 bomba peristáltica o de forma descendente por punción inferior del tubo y utilizar secuencialmente una serie de tubos recolectores para cada organelo. Centrifugación en gradiente de densidad utiliza soluciones que presentan una gama de densidades de forma ascendente de la superficie al fondo del tubo o descendente del fondo del tubo a la superficie: Aparato de golgi: 1.06 Membrana Citoplasmática: 1.15 REL: 1.16 Mitocondrias: 1.19 Núcleo: Antes de realizar la centrifugación hay que realizar una fragmentación celular (sonicación, fraccionamiento químico, etc). TÉCNICAS PARA SEPARACIÓN Y ANÁLISIS ELECTROFORESIS Es el movimiento de partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico; las partículas con carga negativa migran al ánodo (aniones) y las cargadas positivamente migran al cátodo (cationes). La electroforesis es el sistema estándar utilizado para separar, identificar y purificar moléculas. La separación de las moléculas se realiza mediante el uso de soluciones iónicas amortiguadoras (buffers) que confieren carga eléctrica a las moléculas y las obliga a desplazarse hacia el extremo del gel que posee la carga opuesta. Algunas partículas tienen cargas tanto negativas como positivas debido a la existencia de diferentes grupos funcionales en las moléculas. La carga de estas partículas es la carga neta y depende de la solución en la que se encuentre disuelta. Las partículas que pueden tener cargas positivas y negativas se denominan Switer Iones entre los que se encuentran aminoácidos, proteínas, alcaloides, etc. Existen sustancias las cuales están exclusivamente cargadas positivamente o negativamente, lo que facilita su separación como lo son los ácidos nucleicos, ácidos o bases orgánicos y fenoles entre otros. En el caso particular de la Biología Molecular, la electroforesis es utilizada para el análisis de ácidos nucleicos. La técnica permite la separación de fragmentos

8 de DNA que no pueden ser separados adecuadamente mediante otros procedimientos como la centrifugación en gradiente de densidad. Dependiendo del objetivo de la electroforesis se pueden utilizar diferentes soportes, siendo los más utilizados los geles de agarosa y los de poliacrilamida. Hay varios factores que afectan la tasa de migración del DNA durante la electroforesis, estos son: Tamaño de la Molécula Concentración del Soporte (Agarosa, Poliacrilamida etc.) Conformación del DNA Voltaje aplicado Dirección del campo eléctrico Composición en bases del DNA y temperatura del sistema Presencia de colorantes intercalantes Composición del buffer de electroforesis Para un determinado medio, a mayor voltaje, mas rápidamente se mueven las partículas y menos tiempo se requiere para la separación de éstas, pero hay valores óptimos de voltaje que dependen de la naturaleza de cada medio. Voltajes altos generan mucho calor, lo cual podría deshidratar el medio y perder su fluidez. En cuanto a la composición del buffer de electroforesis, medios con bastante absorción o interacción con las sustancias a separar y medios con poca o ninguna interacción con dichas sustancias. La retención disminuye la velocidad de las partículas lo que conlleva el uso de voltajes altos o tiempos muy largos para que ocurra la separación. Geles de Agarosa La electroforesis en gel de agarosa es un método estándar usado para separar, identificar y purificar fragmentos de DNA. La agarosa extraída de las algas es un polímero linear compuesto básicamente por D y L- galactosa. La agarosa forma una matríz que sirve o actúa como un cedazo molecular para separar fragmentos de DNA de diferentes tamaños. La agarosa se encuentra comercialmente disponible con variaciones en su pureza. Se recomienda un grado de agarosa ultra-pura que esté libre de DNAsas. El tamaño de los fragmentos analizados está en el rango de los 150 bp a 2500 bp. Para la separación de fragmentos de alto peso molecular se debe usar bajas concentraciones de agarosa, para la separación de fragmentos pequeños se usan altas concentraciones de agarosa. Tamaño Concentración de Agarosa bp % bp 1-2% bp 3 %

9 Los fragmentos pequeños migran más rápido que los fragmentos grandes. La forma del DNA determina el patrón de migración; DNA circular cerrado>dna linear>dna circular abierto. La migración del DNA es directamente proporcional al voltaje aplicado. Voltajes muy altos o muy bajos no son recomendados. El voltaje normal debe ser 5-10 voltios /cm. La distancia en cm está referida a la longitud del gel entre los electrodos negativo y positivo. Voltajes altos generan mucho calor lo que puede alterar los geles. Normalmente se adiciona 10 ul de bromuro de etidio (10 mg/ml) para 100 ml de solución de agarosa, (esperar a que la temperatura descienda a los C). El bromuro de etido es mutagénico por lo cual se deben usar guantes cuando se trabaje con este material y debe ser colectado en un contenedor especial. El bromuro de etidio se utiliza para colorear moléculas de DNA o RNA, el cual se intercala entre las cadenas complementarias de la doble hélice o en las regiones de estructuras secundarias del DNA de cadena sencilla o del RNA. Su color es naranja fluorescente cuando se ilumina con luz UV. La ventaja de adicionar bromuro de etidio al gel de agarosa es que las bandas de DNA pueden ser coloreadas y monitoreadas con luz UV. La desventaja es que tanto el gel como el aparato de electroforesis son contaminados con bromuro, entonces alternativamente se puede realizar el corrido sin coloración y el gel es coloreado después del corrido minutos en un tanque con agua y bromuro de etidio en la oscuridad ( 5 ul por 50 ml de agua destilada). Buffer de Carga: es un buffer contiene sucrosa o glicerol, lo cual da peso a la muestra para que el DNA se precipite al fondo de los pozos de siembra y los colorantes (azul de bromofenol, cylen xyanol, naranja de acridina, etc) permiten identificar el frente de corrido. Se usan marcadores de peso molecular para tener una referencia del tamaño de los fragmentos por separar e identificar. Poliacrilamida La Acrilamida es un monómero que en presencia de radicales libres (persultato de amonio y temed) forma con la bis-acrilamida cadenas que se entrecruzan de tal forma que crean un polímero de porosidad variable. Dicha porosidad es determinada por la longitud de las cadenas y el grado de entrecruzamiento molecular. Las ventajas de usar poliacrilamida con respecto a la electroforesis de agarosa son: Posee un mayor poder de resolución Permite la aplicación de concentraciones variables de DNA sin alteración significativa de resolución El DNA recuperado de estos geles es muy puro. Existen dos tipos de geles de poliacrilamida: Denaturantes No Denaturantes

10 Los Denaturantes permiten el análisis de DNA de cadena sencilla. Estos geles son polimerizados en presencia de agentes denaturantes como Urea o Formamida. Los no denaturantes permiten el análisis de DNA de cadena doble. Los geles tienen diferentes espesores dependiendo del cross-linking, los más delgados mm influyen en la resolución y por lo tanto mayor información de la secuencia del DNA. CROMATOGRAFÍA Es una técnica de separación de mezclas complejas de solutos basándose en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a través de un medio poroso, arrastrado por un disolvente en movimiento en una solución. La retención o la permanencia de los componentes de la mezcla en las fases son debido a diferentes fenómenos: Adsorción Reparto Intercambio Iónico Adsorción: es la fijación de una sustancia en una superficie de un sólido, la cual puede deberse a fuerzas físicas (fisisorción) o a fuerzas químicas (quimisorción). La fisisorción ocurre por atracción de las sustancias hacia la superficie del sólido por fuerzas Van Der Waals o campos eléctricos o magnéticos. La quimisorción ocurre por formación de enlaces reversibles como puentes de hidrógeno. Reparto: Es la distribución de una sustancia (soluto) entre dos fases líquidas inmiscibles entre si. La relación entre las cantidades de soluto disuelto en cada una de las dos fases se denomina coeficiente de reparto (K). K = CA CB CA = Cantidad del soluto S en fase A CB = Cantidad del soluto S en fase B. Intercambio Iónico: Es el desplazamiento de un Ión desde una matriz por otro que puede ser retenido mas fuertemente. La matriz está formada por una resina insoluble que puede tener grupos cargados negativamente (intercambio de iones positivos) o cargados positivamente (intercambio de iones negativos). Así la migración esta determinada por el desplazamiento de disolventes adecuados y la separación por el hecho de que las diversas sustancias que componen las mezclas se mueven en el medio poroso a velocidades diferentes. La separación de los componentes de la mezcla se reparten entre una fase portadora móvil (gas o líquido) y otra fase estacionaria, liquida o sólida. Durante este proceso, la fase móvil se utiliza para el transporte de la mezcla de muestra

11 a través o a lo largo de otra fase inmiscible o de una superficie absorbente, que permanece estacionaria, los componentes químicos de la mezcla se desplazan de la fase móvil a la fase estacionaria para volver nuevamente a la fase móvil, repitiéndose muchas veces sobre el desplazamiento. Las técnicas cromatográficas se clasifican según el fenómeno de separación, según el estado físico de las fases y según la forma como se desarrolla la cromatografía. 1. Según el estado físico de las fases, tenemos: Cromatografía Líquida: Ampliamente usada en la industria y la farmacología para el análisis de compuestos solubles pero no volátiles. La fase móvil es un líquido, la fase estacionaria puede ser un sólido como microesferas de sílice porosa, las cuales pueden ser modificadas químicamente para conseguir un producto con diferentes características cromatográficas, también se usa Alúmina (Al2O3), Oxido de Magnesio (MgO), carbón vegetal, Carbonato de Calcio, Florisil (sílica gel y magnesia), etc. Los Fractogeles (producto comercial) son agregados de esferas muy pequeñas de polímeros especiales que dejan poros de diferente diámetro según el tamaño de las mismas. Son muy uniformes y resistentes a las presiones altas. Las hay hidrofilicas, lipofilicas y de varios tamaños de poro y grano. La actividad de un adsorbente (fase estacionaria) está determinada por la capacidad de retener una determinada sustancia. La humedad retenida por el adsorberte disminuye la capacidad para retener otra sustancia, ya que al estar ocupados los sitios de retención (sitios activos) por el agua, esta no puede ser reemplazada por su alta polaridad. Para activar un adsorbente se le somete a secado a temperaturas cercanas a los 100 o C por un tiempo determinado. La retención de una fase estacionaria depende de: La naturaleza de la fase estacionaria El grado de activación El tamaño del grano Así, cada fase tiene una retención natural dependiendo de su estructura cristalina y molecular; el grado de activación está relacionado con el número de sitios activos libres; a mayor número de sitios activos libres mayor actividad. Un absorbente de grano fino retiene más que uno de grano grueso pero permite una menor porosidad para el paso del solvente, obteniéndose flujos muy bajos.

12 La fase móvil (solvente) compite por la sustancia retenida en la fase estacionaria en base a la solubilidad de ella. El solvente debe tener la capacidad de absorber la sustancia retenida; esto ocurre si la fuerza de atracción hacia el solvente es mayor que la fuerza de atracción hacia la fase estacionaria. La adecuada elección de la fase móvil depende de la polaridad y de la viscosidad de la misma, ya que, componentes de alta viscosidad requieren operar con presiones mas altas, lo que conlleva a una reducción en el tiempo de vida de la columna y a un incremento en la frecuencia de escapes de líquidos. Dentro de los solventes más utilizados están: Eter de petroleo Hexanos Benceno Menor Polaridad Mayor Polaridad Tolueno Cloroformo Didorometano Eter etílico Acetato de etilo Acetona Etanol Metanol Agua Cromatografía Gaseosa La fase móvil o gas portador es un gas de gran pureza el cual es suministrado a alta presión y a flujo constante. La fase estacionaria puede ser líquida, siendo muy usado el OV-17, un polímero de fenil-metil silicona con elevado punto de ebullición. La fase estacionaría puede ser sólida, siendo la sílice la mas utilizada. 2. Según la forma como se desarrolla la cromatografía (depende del dispositivo utilizado), tenemos: Cromatografía en columna Para separar una mezcla de sustancias por cromatografía en una columna se prepara una columna de material retenedor o fase estacionaría y un líquido como fase móvil. Uno de los usos de este sistema es la producción de agua desionizada, utilizando un intercambiador iónico que convierte cualquier catión presente en hidrogeniones y cualquier anión presente en iones hidroxilo. Los hidrogeniones reaccionan con los iones hidroxilo para producir agua.

13 Cromatografía Plana Aquí la fase estacionaria está colocada en una superficie plana y puede ser: Cromatografía en Papel Cromatografía en Capa fina Cromatografía en Papel: La fase estacionaria es un papel Cromatografía en Capa fina: La fase estacionaria (gel de silicio y alúmina) se extiende sobre una placa de vidrio o metal. 3. Según el fenómeno de separación, tenemos: Cromatografía de adsorción Cromatografía de reparto o partición Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de permeación o filtración en gel. En la cromatografía de permeación o filtración en gel se usan fases estacionarias compuestas por sólidos porosos que se dilatan con agua o solventes lipofílicos según el caso; de ellos son conocidos el Sephadex, (producto comercial), que consiste en un sólido poroso formado por fibras entrecruzadas de dextrano, las cuales dejan pasar moléculas de diferentes tamaños según el diámetro de los poros.