Retrovirus: HIV 2 parte

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Milagros Sandra Ramos Naranjo
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1 Infecciones Virales Transmisibles por Vía Transfusional: Hitos, Paradigmas, Aprendizajes. Fundación Hemocentro Buenos Aires Retrovirus: HIV 2 parte Dra. Mirta Remesar Laboratorio de ITT, Centro Regional de Hemoterapia Dra. Andrea Mangano Lab. Biología Celular y Retrovirus- CONICET Hospital de Pediatría Juan P. Garrahan 7 de Noviembre de 2013

2 Inf. Primaria Fase Asintomática SIDA / Muerte Linfocitos T CD4+ (cels/ ul) Viremia Síndrome HIV agudo Infecciones Oportunistas Carga Viral Semanas 1 a 15 + años Años a 3 + años 10 2

4 Historia natural de la infección temprana Luego de la transmisión: Fase de eclipse, la infección se establece en los tejidos cercanos al sitio de exposición, pero la diseminación a niveles detectables en circulación sistémica no ocurre aún Una vez producida la diseminación al tejido linfoide y circulación, la replicación del virus se incrementa rápidamente, con un tiempo de duplicación (doubling time) de 20 horas Estadío I: Replicación Exponencial (Ramp up viremia), sólo se detecta ARN viral Estadío II: ~ 7 días después se detecta el antígeno p24, proteína del core de la partícula viral, es detectable una vez que el ARN viral alcanza las copias/ml aproximadamente.

5 Historia natural de la infección temprana Estadío III: ~ 5 días después, se hacen detectables los anticuerpos con los ensayos de Elisa de tercera generación. Una a dos semanas luego de la aparición de síntomas de la infección retroviral aguda. Estadío IV: Puede observarse un patrón indeterminado en Western blot, ~ 3 días después de las pruebas reactivas por Elisa Estadío V: Conversión a Western blot claramente positivo, luego de 7 días más, ~ 1 mes luego de la infección inicial (sin banda p31)

8 Algoritmo en donantes de sangre Elisa No reactivo Inicialmente reactivo Se repite por duplicado Se informa No reactivo Ausencia de bandas Rep. no reactivas Western blot 2 de 3 reactivos Se informa Reactivo Patrón incompletopatrón suficiente Negativo Indeterminado Positivo

9 Prueba confirmatoria: Western blot Criterios de interpretación para positividad CDC: Presencia de dos de las siguientes bandas: p24, gp41, gp160/120 OMS: Dos bandas de ENV con o sin GAG o POL Cruz Roja Estadounidense: Una banda de GAG, una de POL y otra de ENV ENV: gp160, gp120/110, gp41 GAG: p55, p40, p24, p18 POL: p68/65, p52/51, p34/32.

10 Prueba confirmatoria: Western blot

11 Periodo de ventana en un modelo animal: puede prevenirse la transmisión de HIV con NAT?

12 Curso de la infección por VIH en chimpancé X034 por inoculación secundaria en CH X176 CH X034 fue inoculado con 38 DICT50 de VIH 1 IIIB No se observaron eventos serológicos o moleculares en las primeras 4 semanas luego de la inoculación Semana 5: ARN VIH +, ADN VIH+ en células periféricas de la sangre, cultivo + Semana 8: p24+ y a-vih+ El plasma obtenido luego de 3 semanas fue inoculado en CH X176, no causó infección, aún luego de un periodo de incubación de 24 semanas A partir de la semana 5 post-inoculación de CH X034, el plasma y células obtenidas de él son capaces de infectar a CHX176 La infectividad se da en paralelo con la detección de ácidos nucleicos

13 Estudios posteriores con monos macacos infectados con el Virus de la Inmunodeficiencia Simia (SIV) mostraron que el inóculo de macacos infectados en la etapa inmediatamente previa a la replicación exponencial del virus ( pre-ramp-up ) era capaz de infectar a macacos sanos, aún cuando esta carga viral de los monos infectados se encontraba por debajo del límite de detección. Se comprobó que el virus de la etapa pre-ramp-up era de mayor potencial infeccioso con respecto al virus presente en la infección ya establecida. Estas experiencias comprueban que la transmisión de la infección por una donación de sangre infectada con bajos niveles de virus y sin anticuerpos es posible. Ma ZM, et al. J. Virology, 2009, 83:

14 Estimación de la incidencia de la infección por VIH Las estimaciones de incidencia de la infección en una población dada son críticas para: La caracterización epidemiológica de la misma La evaluación de programas de prevención de VIH El diseño y evaluación de investigaciones epidemiológicas Monitorear los patrones de transmisión Conocer los target de la infección, donde se dirigirán los mayores esfuerzos en prevención

15 Estimación de la incidencia de la infección por VIH Estudios transversales para la presencia de anticuerpos Detuned Elisa : Jannsen et al (JAMA 1998;280:42) desarrollaron un ensayo basado en la detección de anticuerpos a-igg de formación reciente. Se basa en una dilución mayor de la muestra con respecto a la prueba convencional. El concepto: las muestras con menor título de anticuerpos y menor afinidad serían negativas. Las muestras positivas por la prueba convencional pero negativas por detuned Elisa eran consideradas de infección reciente (dentro de los 4 meses precedentes). Ventajas: Relativamente fácil de realizar, no requiere de métodos complejos. Desventajas: No es totalmente exacta Otras pruebas: Avidez, Elisa de a-hiv-1 de captura

16 Estimación de la incidencia de la infección por VIH Estudios de cohorte: Seguimiento de grupos de riesgo hasta observar seroconversión Desventajas: Pérdida de individuos, pueden introducirse sesgos al recibir consejo sobre prevención de la infección. Requiere tiempo, alto costo Es dificultoso el seguimiento frecuente de un alto número de individuos de manera tal de detectar la seroconversión en un momento cercano a su ocurrencia en la realidad Estudios tranversales: Detección viral antes de la formación de anticuerpos en una población de riesgo o en la población general. Ej: NAT en donantes de sangre Ventajas: Es representativo de la población en estudio Desventajas: Requiere del estudio de un alto número de individuos con el consiguiente costo que esto significa.

18 NAT en donantes de sangre: Métodos Extracción de ácidos nucleicos por lisis viral en la cual las proteínas de envoltura y cápside son removidas Purificación de los ácidos nucleicos por métodos bioquímicos, captura por sondas específicas o unión a sílica o fases sólidas Eliminación de impurezas y resuspensión de los ácidos nucleicos Amplificación: Billones de copias de las secuencias target Detección por métodos colorimétricos, quimioluminiscentes o fluorescentes

19 PCR: Amplificación en cadena por la polimerasa (Polymerase chain reaction amplification) Mullis y Faloona, 1987 El descubrimiento de una enzima polimerasa termoestable en una bacteria, Thermus aquaticus (Taq), permitió realizar varios ciclos de amplificación sin necesidad de agregar nueva polimerasa Virus a ARN: Transcripción reversa para obtener cadn cadn es desnaturalizado en cadenas simples por calentamiento a 94 C

20 PCR: Amplificación en cadena por la polimerasa Se reduce la temperatura para permitir la unión de oligonucleótidos sintéticos complementarios a la región de interés (primers) en las cadenas simples La temperatura se eleva a la temperatura óptima para la extensión de la hebra complementaria de ADN por la Taq polimerasa, permitiendo obtener dos nuevas cadenas (en ambos sentidos de copiado) En 30 o más ciclos de idénticas condiciones se obtienen más de 10 9 copias

22 PCR en tiempo real (Real Time PCR) Está basada en la PCR convencional, pero la cantidad de amplicones producidos es medida durante la reacción, permitiendo la totalidad del ensayo en un mismo tubo. El método más conocido es el de TaqMan PCR, donde la medición se realiza por una sonda de oligonucleótidos de marcación fluorescente dual. La sonda posee un compuesto fluorescente con diferente longitud de onda de excitación y emisión en cada extremo (reporter y quencher). La longitud de onda de la excitación del quencher es similar a la de emisión del reporter, de manera que cuando reporter y quencher están próximos la energía emitida por el reporter es absorbida por el quencher en un proceso conocido como transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) (Forster, 1948)

23 PCR en tiempo real La sonda de marcación dual posee una temperatura de unión mayor a la de los primers Por lo tanto, cuando la temperatura disminuye luego de la denaturalización la sonda se une a la secuencia target antes que los primers Durante la extensión, la sonda marcada es hidrolisada por la actividad 5 exonucleasa de la Taq polimerasa Una vez hidrolisada la sonda, el reporter y quencher no están cercanos y no ocurre el fenómeno FRET, emitiéndose luz por el fluoróforo del reporter En cada ciclo de PCR, la sonda es hidrolisada, aumentando la emisión fluorescente El incremento en emisión del reporter es medido luego de cada ciclo de PCR y es proporcional a la cantidad de amplicones generados en cada reacción

25 TMA: Amplificación mediada por transcripción (Transcription mediated amplification) Es un método de amplificación isotérmica. Las secuencias virales son capturadas del plasma por oligonucleótidos de captura. Usa dos enzimas: transcriptasa reversa y una ARN polimerasa (T7)

26 TMA: Amplificación mediada por transcripción Un primer con la secuencia del promotor de la ARN polimerasa reconoce el templado de ARN para comenzar la síntesis de un cadn con la transcriptasa reversa El ARN es luego degradado por la actividad de RNAsa H dejando una sola cadena de ADN que ahora incluye la secuencia del promotor Otro primer es luego usado para generar la cadena complementaria. La ARN polimerasa genera de 100 a 1000 copias de ARN a partir del templado de ADN y comienza el proceso nuevamente.

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