Detección de ADN de Trypanosoma cruzi por Reacción en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real

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Emilia Domínguez García
hace 5 años
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1 Detección de ADN de Trypanosoma cruzi por Reacción en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real Prác%ca Profesional Obligatoria Área Parasitología Docentes: Dra. Victoria Alonso Dra. Pamela Cribb Dra. Romina Manarin Dra. Virginia Perdomo

2 Ciclo de vida de Trypanosoma cruzi

3 Enfermedad de Chagas En 1909, Carlos Chagas la descubre y es la primera vez en la historia de la medicina que una enfermedad se descubre simultáneamente con su agente egológico y el vector que la transmite. Transmisión de la enfermedad: vectorial, congénita, transfusión, transplante de órganos, vía oral y accidentes de laboratorio.

4 Diagnós%co de la Enfermedad de Chagas Es necesario considerar los antecedentes epidemiológicos del paciente que indiquen el posible contacto directo o indirecto con el parásito y evidencias clínicas. Finalmente el diagnósgco de la infección requiere de la confirmación de laboratorio: Por la detección del T. cruzi (DIRECTO) Por serología (INDIRECTO)

5 DiagnósGco clínico-epidemiológico FASE AGUDA 4-8 semanas Puede confundirse con varias infecciones febriles puesto que la sintomatología no sigue un patrón caracterísgco. FASE CRONICA Persiste toda la vida del paciente. Es más diocil orientar el diagnósgco. La miocardigs, los antecedentes de haber vivido en una región endémica de la enfermedad de Chagas y las alteraciones radiológicas y electrocardiográficas son herramientas fundamentales para orientar al médico. hacia el diagnósgco de la enfermedad de Chagas

6 DiagnósGco de laboratorio FASE AGUDA Parasitemia. En la fase aguda se uglizan métodos parasitológicos tanto directos (examen de sangre al fresco, extendido coloreado y gota gruesa) como indirectos (xenodiagnósgco, hemoculgvo e inoculación en animales sensibles) y técnicas de concentración (strout y µstrout). FASE CRONICA Si bien la parasitemia persiste, es casi indetectable. IgG (técnicas serológicas indirectas). Las técnicas más uglizadas en la actualidad son el E L I S A, l a HemagluGnación indirecta (HAI) e Inmunofluorescencia indirecta (IFI). Sin embargo, estas técnicas pueden ser poco específicas, ya que pueden dar reacciones cruzadas con otros parásitos. Las técnicas de biología molecular han generado an[genos recombinantes y pépgdos sintégcos para uglizar en los ensayos inmunológicos y en algunos casos han demostrado la detección de angcuerpos en individuos en fase crónica de la enfermedad, con una alta sensibilidad y especificidad. Debido a esto la OMS recomienda aplicar al menos dos técnicas con la finalidad de tener un alto grado de confiabilidad, sugiriéndose una tercera prueba en caso de discrepancia entre ellas.

7 DiagnósGco molecular Estos métodos se caracterizan por ser específicos y poseer elevada sensibilidad, ya que detectan el ADN del parásito, aunque exista una cangdad pequeña de estos en la circulación sanguínea. En un principio se usaron las técnicas de hibridación y actualmente el diagnósgco molecular se basa en la detección de fragmentos específicos de ADN del genoma del parásito mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), que Gene como finalidad amplificar una secuencia específica del ADN de T. cruzi. Sin embargo, su uso para diagnósgco aún es controversial y se ugliza en determinadas circunstancias

8 U%lidad de la PCR en el diagnós%co de Chagas Existe una serie de circunstancias en las cuales el diagnósgco molecular por PCR es una alternagva muy importante, por ejemplo: infecciones con baja parasitemia Chagas congénito, en recién nacidos En inmunodeficiencias o pacientes inmunocompromegdos (cuya producción de ACS es deficiente) Para seguimiento del tratamiento. Se desarrollaron diferentes protocolos basados en la amplificación de diferentes dianas para el diagnósgco de infección con T. cruzi.

9 Protocolos de PCR

10 PCR en Gempo real La PCR cuangtagva (qpcr o Q-PCR, del inglés Quan0ta0ve Polymerase Chain Reac0on;) o PCR en Gempo real (del inglés Real Time PCR) es una variante de la PCR uglizada para amplificar y simultáneamente cuangficar de forma absoluta el producto de la amplificación del ADN. Para ello emplea, del mismo modo que la PCR convencional, un molde de ADN, cebadores específicos, dntps, tampón de reacción y una ADN polimerasa termoestable. Se le añade una sonda marcada con un fluoróforo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia, tras excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada, permite medir la tasa de generación de uno o más productos específicos. Dicha medición, se realiza luego de cada ciclo de amplificación y es por esto que también se le denomina PCR en Gempo real, mientras que en la PCR convencional los resultados se ven al finalizar la corrida, por lo que también se la llama PCR de punto final.

11 Polymerase chain reacgon (PCR) Targeted sequence Primers Cycle I Cycle II Cycle III

12 PCR convencional vs PCR en Gempo real Menor sensibilidad Menor costo Menos rápida Mayor sensibilidad Más costosa Más rápida

Sondas TaqMan Las sondas TaqMan permiten medir la producción de productos de PCR mediante un sistema de sondas marcadas mediante dos fluorocromos.

13 Sondas TaqMan Las sondas TaqMan permiten medir la producción de productos de PCR mediante un sistema de sondas marcadas mediante dos fluorocromos. Su uglidad radica en que poseen un fluoróforo en su extremo 3' y una molécula quencher en el 5'; esta sonda marcada hibrida específicamente en la parte central del producto de PCR a obtener. De este modo, cuando se efectúa la PCR, la sonda híbrida en el amplicón pero no se emite fluorescencia; cuando la polimerasa se topa con la sonda la hidroliza mediante su acgvidad exonucleasa 5'-3', lo cual provoca la separación del quencher del fluorocromo y, por tanto, la emisión de fluorescencia. Fluorescencia que está relacionada con la can%dad de amplicón producido.

Resumen Protocolo 1) Purificación de ADN con par[culas de sílica 2) Preparar mezclas de reacción 3) Correr 4) Analizar resultados Componente de la mezcla qpcr UDG

15 Resumen Protocolo 1) Purificación de ADN con par[culas de sílica 2) Preparar mezclas de reacción 3) Correr 4) Analizar resultados Componente de la mezcla qpcr UDG Mastermix 2X Control (-), (+) o muestra Volumen (µl) 10 5 H 2 O 5 Volumen final 20 Posición A PC alto PC medio PC bajo M1 M1 M2 M2 NC PC (control posigvo)

Curva standard Dilución Eq parásitos/ml PC T. cruzi - 1.

medio 1/1.000 1 Tubo 4: PC bajo 1/10.000 0.

16 Curva standard Dilución Eq parásitos/ml PC T. cruzi Tubo 1 1/ Tubo 2: PC alto 1/ Tubo 3: PC medio 1/ Tubo 4: PC bajo 1/ Sólo se corren éstos 2 µl PC T. cruzi 2 µl 2 µl 2 µl H 2 O: 18 µl

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