Título de la presentación en un máximo de dos líneas

Transcripción

1 Título de la presentación en un máximo de dos líneas Diagnóstico de Laboratorio de la Enfermedad de Chagas Diferentes Escenarios María Isabel Jercic Lara Sección Parasitología 2011

2 Se registran casos en todo el territorio nacional. Antecedentes No se tiene registros de casos por transmisión vectorial en los últimos años. Certificado de Interrupción 1999 Encuesta calidad de vida 2010 Encuesta Prevalencia para la población general es de 0.7 % personas aproximadamente 0,33 % en Donantes de Sangre.

3 Puertas de entrada para la pesquisa de pacientes infectados con Trypanosoma cruzi 1 Donantes de Sangre - Principal fuente de pesquisa de nuevos casos. - Tamizaje en todo el territorio nacional (2008). - Se pretende conseguir Certificación de la interrupción Transfusional de la infección. 2 Tamizaje Embarazadas - Principal mecanismo activo de transmisión de la infección en nuestro país. - Iniciativa de algunos SS de incorporar el tamizaje a embarazadas.

4 Puertas de entrada para la pesquisa de pacientes infectados con Trypanosoma cruzi 3 Sospecha clínica o descarte de infección -Pacientes provenientes de áreas tradicionalmente endémicas. -Viajes -Transmisión oral - Síndrome de TORCH - Pacientes inmunocomprometidos - Estudios pre y post-transplante. 4 Estudios Serológicos - Apoyar a la evaluación de la situación de interrupción de la transmisión vectorial. - Búsqueda de nuevos casos de infección por la vía vectorial.

5 Aporte al diagnóstico en diferentes escenarios Exámenes de Laboratorio

6 Diagnóstico de Laboratorio Diagnóstico Directo Diagnóstico Indirecto Diagnóstico Molecular Buscar el parásito Buscar Anticuerpos específicos Buscar material genético

7 Perfil de marcadores ETAPA AGUDA ETAPA CRÓNICA DNA IgG IgM Infección Directo Aproximación en Semanas

8 Técnicas más empleadas Diagnóstico Directo Observación del parásito Observación Microscópica Gota Gruesa Frotis MicroStrout Biopsia

9 Búsqueda de Anticuerpos Diagnóstico Indirecto Técnicas más empleadas Tamizaje Confirmación ELISA Aglutinación de Partículas (HAI) Inmunocromatografía IFI Western Blot

10 Diagnóstico Molecular Técnicas más empleadas PCR convencional PCR Tiempo real Cuantifica el número de copias

11 Selección de los métodos Dependerá del tipo de paciente y la etapa de la enfermedad Directos y Moleculares Etapa Aguda Infección reciente Recién Nacidos Inmunocomprometidos Indirectos Etapa crónica

12 Las entradas más frecuentes

13 Servicios de Sangre Persona aparentemente sana Proceso de donación Tamizaje Requiere Confirmación

14 Métodos Indirectos Diagnóstico Indirecto TAMIZAJE Sensibilidad <Etapa aguda >Etapa crónica REACTIVO INDETERMINADO NO REACTIVO Repetir en Duplicado INFORMAR REACTIVO REACTIVO REACTIVO NO REACTIVO NO CONCLUYENTE NO REACTIVO NO REACTIVO ENVIAR A CONFIRMACIÓN INFORMAR

15 ELISA para la detección de Anticuerpos IgG contra T.cruzi Técnica de tamizaje, sencilla, rápida y aplicable a un gran número de personas simultáneamente. No hace diagnóstico de la enfermedad por si sola, y un resultado positivo no puede ser informado directamente al paciente o donante. S S E S E S E S C E S E S E S S Requisitos de calidad: 100% Sensibilidad > 90% Especificidad

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17 Reactivos Evaluados Nombre del Reactivo Fabricante Nº Lote Sensibilidad % Especificidad % Concordancia % Año CHAGATEST ELISA recombinante v3 WIENER LAB., ARGENTINA ,8 99, TEST ELISA PARA CHAGAS II BIOS CHILE, INGENIERIA GENETICA S.A ,8 99, INMULITE CHAGAS IgG DIAGNOSTIC PRODUCTS CORPORATION LKCS ,9 76,4 85, TEST ELISA PARA CHAGAS III BIOS CHILE, INGENIERIA GENETICA S.A BIOELISA CHAGAS BIOKIT S.A C ELISA Chagatek BIOMERIEUX BRASIL S.A ,3 98, *SMART COMB CHAGAS Ab TEST ELISA PARA CHAGAS III SMARTEST DIAGNOSTICS, ISRAEL ,9 70,7 84, BIOS CHILE, INGENIERIA GENETICA S.A ARCHITECT CHAGAS Abott Diagnóstics 94154HN CHAGASTEST ELISA recombinante v 4.0 WINER LAB ARGENTINA

18 Confirmación Hospital de Iquique Laboratorios reconocidos Laboratorio de Referencia IFI IFI WB Hospital de La Serena Hospital San Borja Arriarán Hospital Universidad Católica Hospital Gustavo Fricke Hospital Van Buren En Chile no se realiza en los Servicios de Sangre

19 Examen de Confirmación Laboratorios Reconocidos Técnicas realizadas por Centros Reconocidos por el Laboratorio de Referencia de Parasitología del Instituto de Salud Pública (ISP) Se pueden emplear Inmunofluorescencia Indirecta Se emplean hoy Su resultado positivo valida el resultado de la prueba de tamizaje y puede ser informado al paciente Requisitos de calidad 100% Sensibilidad > 95% Especificidad F

20 En Chile Instituto de Salud Pública Confirmación Laboratorios reconocidos Laboratorio de Referencia IFI IFI WB

21 Examen de Confirmación Técnicas realizadas por el Laboratorio de Referencia de Parasitología del Instituto de Salud Pública (ISP). Su resultado positivo valida el resultado de la prueba de tamizaje y puede ser informado al paciente Se pueden emplear Se emplean hoy Inmunofluorescencia Indirecta Western blot Enzimoinmuno ensayo IgG Requisitos de calidad 100% Sensibilidad 98% Especificidad Se acepta 2 % No concluyentes

22 Tamizaje mujeres embarazadas Embarazada en 2º trimestre Confirmar Resultado Positivo Laboratorio reconocido Tamizaje Laboratorio Embarazada Infectada confirmada Estudio Infección transplacentaria

23 Recién Nacido o Lactante Hijo de madre con Enfermedad de Chagas 1 ml de sangre PARA EXAMENES DIRECTOS 2 ml de sangre con anticoagulante o Guanidina PARA PCR (K-N) POSITIVO CONFIRMADO NEGATIVO No Detectable Positivo en 2 ocasiones TRATAMIENTO Y SEGUIMIENTO ESPERAR RESULTADO PCR O SEGUMIENTOM CON EXAMENES INDIRECTOS No Detectable 2ª muestra segundo mes de vida Positivo en 2 ocasiones 3ª muestra 9 mes de vida CONFIRMADO No Detectable Positivo DESCARTADO CONFIRMADO

24 Reacción en cadena de la polimerasa para T. cruzi (PCR) Técnica que detecta y amplifica secuencias de DNA específicas para Trypanosoma cruzi

25 Estudio Serológico Niños Menores de 5 años Muestra de Sangre en papel filtro Estudio familiar y de caso índice

26 Algoritmos de Laboratorio Consideraciones Especiales

27 Diagnóstico Directo POSITIVO NEGATIVO Sensibilidad >Etapa aguda <Etapa crónica INFORMAR Si sigue la sospecha REPETIR o enviar al ISP

28 Búsqueda de Anticuerpos Diagnóstico Indirecto Tamizaje Confirmación

29 Métodos Moleculares Sensibilidad >Etapa aguda <Etapa crónica > de 9 meses < de 9 meses inmunocomprometidos

30 Menores de 9 meses e inmunocomprometidos Muestra con DNA detectable Positivo No detectable Se requieren una 2ª para confirmar resultado Seguimiento Límite de detección Partidores empleados K-N

31 Mayores de 9 meses Paciente con serología Positiva confirmada Positivo No detectable Límite de detección Partidores empleados

32 Mayores de 9 meses Paciente con serología Negativa Inmunocomprometidos Positivo No detectable Se requieren una 2ª para confirmar resultado Límite de detección Partidores empleados

33 Algunas Cifras

34 Total de Muestras analizadas para búsqueda de Anticuerpos contra Trypanosoma cruzi por el ISP (Octubre) Diagnósticos Confirmaciones

35 Porcentaje de confirmación de muestras con tamizaje positivo para Trypanosoma cruzi 90% % 75% 87% 91% 80% 92% 94% 91% 86% 79% Confirmadas Positivas Negativas De 100 muestras con tamizaje positivo, en promedio se confirman solo 86 de ellas.

36 Porcentaje de muestras no concluyentes de las Confirmaciones serológicas ISP para Trypanosoma cruzi (Mayo) Western blot 1,1% 2,4 % 1% 1,2% 3,1% 2,8% 2,5 % 1,6% 2% 0,7% 2,1 % Nuevas muestras Muestras concluidas Porcentaje de Muestras no concluyentes ISP 1,9 %

37 Análisis de distribución Territorial

38 Uso de nuevas herramientas Resultados interesantes

39 Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Tecnología Medica Área de Parasitología Evaluación de la carga parasitaria mediante una reacción en cadena de polimerasa en tiempo real en pacientes infectados con Trypanosoma cruzi posterior al tratamiento con Nifurtimox Tesista: Carolina Oyarzun A. Profesor guía: Beatriz Cancino F. Rodrigo Villarroel V.

40 Resultados 3% 2% 2% 2% 2% 2% 5% Hosp. Dr. Juan Noe Crevanni 5% 7% 43% Hosp. Regional Dr. Ernesto Torres Galdames Hosp. Regional San Jose del Carmen de Copiapo Hosp. de Enfermedades Infecciosas Dr. Lucio Cordoba L. Hosp. Dr. Antonio Tirado Lanas de Ovalle Hosp. Regional de Rancagua Hosp. de Litueche Hosp. Militar Hosp. Ricardo Valenzuela Saez de Rengo 27% 54 pacientes 157 muestras 11 centros hospitalarios Hosp. San Camilo Hosp. San Juan de Dios de Santiago

41 Curva estándar Muestra de fragmentos clonados de la región CP CP

42 Curva de melting Dímeros de primers Producto especifico

43 Carga Parasitaria variable Disminuye Mantiene Aumenta 8% 12% 13% 67%

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45 Conclusión La detección a través de la técnica qpcr es un método más sensible en comparación a la técnica PCR convencional. La qpcr es una técnica útil para el seguimiento de la carga parasitaria en aquellos pacientes tratados con Nifurtimox.

46 Facultad de ciencias de la salud Escuela de Tecnología Médica Área de Parasitología Estandarización e implementación de una PCR múltiplex para la determinación de Trypanosoma cruzi I y II, en Muestras clínicas y Triatominos Alumno: Esteban Rodríguez Profesor guía: Beatriz Cancino

47 Materiales y Métodos Para realizar este trabajo se utilizó de base el realizado por Liarte et.al.(2009), que permitió diferenciar, en una misma PCR, el grupo de parásito presente en muestras clínicas y triatominos. Primers Díaz 7, Díaz 8 y TcSat 4, dirigidos contra el DNA satélite del genoma del parásito. Si bien esta clasificación no es la vigente, se empleó porque Permite en un solo paso, en poco tiempo obtener resultado El Grupo I identificado es el mismo de la nueva clasificación El Grupo II identificado corresponde a: Grupo II actual más los Grupos III, IV, V y VI El Grupo de muestras caracterizado como II será posteriormente estudiado por Hibridación por Southern blot

48 Resultados Distribución de los grupos por tipo de paciente Pacientes agudos 42% 58% grupo I % grupo II % Analizado por el método estadístico X 2, que demostró que los resultados no son estadísticamente significativos (p=0,52015)

49 Distribución de grupos I y II en los Triatominos Mepraia spinolai Triatoma infestans 23% 4% grupo I grupo II grupo I grupo II 77% 96% Resultados analizado por el método X 2, que demostró que los resultados son estadísticamente significativos (p=0,024136)

50 Conclusiones Se demostró que la PCR múltiplex es una buena herramienta epidemiológica para determinar el grupo I y II de Trypanosoma cruzi, usando los primers Díaz 7, Díaz 8 y TcSat 4. Su especificidad diagnóstica es de un 100% Se demostró también que existe una mayor frecuencia del grupo I del parásito en muestras clínicas y triatominos.

51 Título de la presentación en un máximo de dos líneas