Inmunoanálisis. Análisis Avanzado de Alimentos. Inmunoanálisis. Inmunoanálisis.

Transcripción

1 Análisis Avanzado de Alimentos Inmunoanálisis Inmunoanálisis. Son técnicas que permiten cuantificar antígenos o anticuerpos, aprovechando la especificidad y sensibilidad de la unión antígeno/anticuerpo. Inmunoanálisis. Ejemplos Residuos de drogas veterinarias (antibióticos: gentamicina, neomicina, cloramfenicol, sulfonamidas, hormonas). Tilosina en miel (a partir de 2005). Cloramfenicol en langostinos (su límite impuesto por FDA y la UE bajaron de 5 ppb a 0.3 ppb). Micotoxinas y otros contaminantes tóxicos: pesticidas, herbicidas. Además: detección de carnes de distintas especies o adulterantes no cárnicos (AOAC: proteína de soja en hamburguesas) Autenticidad de jugos de fruta Adulteración de manteca (girasol) Detección de proteínas de gluten en alimentos para celíacos. Detección de residuos de enzimas de uso tecnológico: papaína en cerveza. Organismos genéticamente modificados (GMO) Immunoprecipitación Inmunoanálisis. 1

2 Marcación de los anticuerpos o antígenos Los antígenos (hormonas, proteínas, pesticidas, etc.) pueden determinarse mediante técnicas que involucran anticuerpos marcados para que la unión antígeno-anticuerpo se haga evidente. Análisis mediante ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assays) Marcación isotópica Fluorescencia Enzimas Elementos para desarrollar un ensayo ELISA Hay varias alternativas: Alternativa 1 Soporte Anticuerpo para unir al soporte (Ab1) Segundo anticuerpo marcado con la enzima Sustrato de la enzima Marcación con enzimas. P S Ab2/E muestra Ab1 La cantidad de color generado por actividad de la enzima sobre un determinado sustrato es proporcional a la cantidad de antígeno o anticuerpo presente. 2

3 Ejemplo: determinación de papaína en cerveza o de glutenina en productos para celíacos (AOAC). Alternativa 2 Soporte Antígeno para unir al soporte Anticuerpo marcado con la enzima Sustrato de la enzima Curva de calibración positiva Este evalúa la cantidad de anticuerpo Ejemplo: determinación de proteínas de soja en hamburguesas (AOAC) remanente luego de reaccionar con la muestra 3

4 1. La muestra reacciona con un anticuerpo titulado Muestra/Ag Ab1 4. Luego del lavado queda unido el Ab en exceso Muestra/Ag Ab1 2. se preparan microplacas con el antígeno unido 5. se agrega un 2do anticuerpo marcado con una enzima 3. El exceso de Ab se une al soporte lavado lavado 6. Luego del lavado se agrega el sustrato Muestra/Ag Ab1 Ab2/E Sustrato producto Otras alternativas En los ensayos competitivos compiten anticuerpos o antígenos libres con aquellos unidos a soporte o enzimas. Siempre reaccionan de preferencia las moléculas libres. 7. El producto se determina por medición de absorbancia a 405 nm 4

5 Esquema ELISA competitivo. Factores clave en el desarrollo de ELISA: Adsorción Unión Lavados Enzimas Anticuerpos Curva de calibración negativa Adsorción Como soporte sólido se emplean microplacas de poliestireno o derivados obtenidos por modificación química o irradiación de la superficie. También pueden ser de PVC El tiempo y la temperatura son los factores críticos que determinan el éxito de la adsorción. Lavados: Se emplean buffers fosfato, Tris o imidazol a ph neutro. 5

6 Actualmente existen en el mercado kits para la realización de ensayos ELISA. Vit B1 Salmonella 6

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8 GMO Para la detección de GMO se puede emplear técnicas tales como análisis inmunológicos (detección de la proteína producida por el gen insertado) o PCR (reacción de la polimerasa en cadena), para la detección de los segmentos del ADN. 8

9 Según el informe de ISAAA, Argentina continúa siendo uno de los principales productores de cultivos transgénicos, luego de EEUU y Brasil, con 23,7 millones de hectáreas en 2011, lo que representa el 14,8% del área global cultivada con transgénicos y un aumento del 3,5% con respecto al año anterior. GMO pruebas basadas en detección de proteínas En cuanto a las aprobaciones regulatorias, Argentina autorizó en 2011 la siembra comercial de tres maíces (MIR162, Bt11 X GA21 X MIR162, DP ) y dos sojas (A , A ), completando la lista de 3 eventos de soja, 16 de maíz y 3 de algodón aprobados hasta el momento. Los tests de la tira reactiva están limitados a las proteínas de eventos genéticos específicos (ej. Bt o Roundup Ready) y por lo tanto, no son útiles para detectar todos los eventos genéticos de GMO. GMO GMO - detección de ADN insertado Reacción Polimerasa en Cadena (ó PCR). El ADN insertado es mucho más estable que las proteínas y está presente en las mismas concentraciones en todo el OGM. Como es imposible detectar a moléculas individuales de ADN, estas se amplifican usando la técnica de la PCR. 9

10 PCR Permite la amplificación de secuencias específicas del ADN en pocas horas, facilitando el análisis cualitativo y cuantitativo de dichas secuencias por medio de técnicas de laboratorio comunes. El procedimiento de la PCR se aplica rutinariamente en el caso de alimentos no procesados, en los que el material genético se encuentra intacto. Su selección se fundamenta en su extrema sensibilidad que, bajo condiciones experimentales óptimas, permite la amplificación de más de un billón de copias de la secuencia deseada a partir de una sola copia del ADN original. Desnaturalización: separación de las cadenas de ADN madre por aumento de la temperatura (94 C). Alineación: se baja la T para permitir el reconocimiento d primer con su secuencia complementaria en hebra de ADN madre ( C). Extensión: la T óptima para actividad de ADN polimerasa (72 C) Lectura de un microchip luego de la hibridación con DNA marcado. Los puntos fluorescentes representan secuencias pertenecientes a GM presentes en la muestra. En primer plano se muestra una ampliación de uno de los 16 campos que conforman el micro-array. Análisis de GMO empleando micro-arreglos de DNA. A, muestra de soja con bajos porcentajes de soja Roundup Ready (2%); B, muestra de maíz con un bajo porcentaje de Bt-176 maize (1%). Amarillo: sondas específicas de GMO; Rojo: DNA control para ver la eficiencia de la hibridización (luciferasa) y especificidad para cada planta: lecitina de soja o invertasa y zeina de maíz. 10