Clase PCR II. Reacción en cadena de la polimerasa. Biología Molecular, Bioquímica 2016 Ivana Kraiselburd

Transcripción

1 Clase PCR II Reacción en cadena de la polimerasa Biología Molecular, Bioquímica 2016 Ivana Kraiselburd

2 PCR: es una técnica para amplificar ácidos nucleicos in vitro, que permite la obtención de grandes cantidades de un fragmento específico de DNA a partir de un molde complejo El ADN de interés es amplificado exponencialmente mediante la síntesis enzimática dirigida por una DNA polimerasa termoestable cebada por 2 oligonucleótidos cebadores (o primers) y por el agregado de desoxirribonucleótidos trifosfatos (dntps)

3 Etapas de cada ciclo de la PCR Desnaturalización: el ADN doble hebra se separa en dos hebras a altas temperaturas (94-95ºC, durante 45 s-1 min). Depende del contenido de GC del molde y su longitud Hibridación de los cebadores a la zona específica de cada una de las hebras por complementariedad de bases. Temperaturas más bajas (55-65º C, durante 30 seg- 1min). T y t dependen de las características particulares de los cebadores utilizados Elongación o extensión del cebador por la DNA polimerasa, la cual cataliza la incorporación de desoxirribonucleótidos siguiendo la cadena molde en la dirección 5-3. Esta etapa será realizada a la temperatura óptima de reacción de la ADN polimerasa (72 C para la Taq polimerasa). Los tiempos dependerán de la prosesividad de la enzima y de la longitud del fragmento a amplificar

4 Conceptos de la PCR Sensibilidad: cantidad mínima de DNA necesaria para que se produzca la amplificación, es decir, para obtener un producto (banda en gel). Se relaciona con los falsos negativos, ya que puede ocurrir que una muestra sea positiva pero sea dada como negativa porque no se ha amplificado por no tener suficiente cantidad de DNA Especificidad: se refiere a la obtención de un solo producto amplificado. Viene determinada por los oligos y la especificidad con la que se unen al DNA molde. De esta forma, si los oligos tienen más de un sitio al que se pueden unir aparecerá más de un producto amplificado Eficiencia- rendimiento: se refiere a la amplificación máxima que se puede obtener en un número determinado de ciclos Fidelidad: se refiere a los errores que comete la DNA polimerasa durante la amplificación. Este concepto es de especial importancia en la secuenciación, pero en otros casos no es tan importante. Una buena fidelidad permite evitar falsos positivos y/o negativos

5 Sensibilidad N de moléculas blanco presentes en la muestra Complejidad de las secuencias blanco Sensibilidad Diseño del Primer Enzima Optimización de la Reacción Concentración de Magnesio Formulación del Buffer Temperatura de Anillado Especificidad-Fidelidad T de anillado (compromiso) Número de ciclos Concentración de Magnesio Concentración y balance de Nucleótidos dntps (10-50 M) Elección de la Enzima Concentración de Primers-cebadores suficientemente alta para la unión rápida al DNA blanco

6 Componentes esenciales de la PCR estándar DNA polimerasa termoestable Oligonucleótidos iniciadores (primers o cebadores) Cationes divalentes: Mg 2+ (MgCl 2 ) Buffer (para mantener el ph de la enzima) DNA molde Desoxirribonucleótidos trifosfatos dntps: se deben utilizar soluciones equimoleculares de los desoxirribonucleótidos datp, dgtp, dctp y dttp H 2 O de alta calidad (doble destilada estéril o MiliQ). Cationes monovalentes Co-Solventes: estabilizan la enzima, influencia la procesividad y/o la T m.

7 DNA polimerasas termoestables Llevan a cabo la síntesis de DNA dependiente del molde Diferentes orígenes:taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus woesei, Pfu Pyrococcus furiosus, Tli Thermococcus littoralis Estabilidad: Taq 9 min a 97 C (40 min a 95 C), Pwo >2 hr a 100 C Procesividad: número promedio de nucleótidos añadidos a la cadena de ADN que se sintetiza, antes de separarse de la cadena molde Fidelidad: frecuencia de incorporación de un nucleótido equivocado (depende MgCl 2, dntps, ph, daño térmico, etc). Fidelidad: Taq baja; Pfu alta; Pfx alta Actividad correctora (proofreading, exonucleasa 3-5 ) y/o reparadora (exonucleasa 5-3 )

8 Características de algunas DNA polimerasas termoestables Taq Stoffel Vent Pfu Fuente Thermus aquaticus Taq truncada sin exo 5-3 Thermococus litoralis Pirococus furiosus Peso molecular Velocidad Procesividad 94 kda 61 kda? 92kDa 75nt/s + 50nt/s + 80nt/s 60 nt/s Vida ½ (95 C) 40 min 90 min 360 min + 2h Exo 5-3 SI NO SI Exo 3-5 NO NO SI SI Mg 2+ óptima 1,5 mm 3 mm 2 mm 1,5-2 mm KCl óptima 50 mm 10 mm 10 mm 10 mm

9 Taq polimerasa Aislada de Thermus aquaticus Fidelidad baja Tasa de error total para la Taq polimerasa: introducción de errores de aproximadamente 1 cada nucleótidos No posee actividad 3-5 exonucleasa Alta procesividad Es muy importante determinar la concentración adecuada de la taq polimerasa en la PCR (0.5 y 2.5 U por reacción) Presenta actividad transferasa terminal en el extremo 3 (agrega una A al extremo 3, especialmente si en el extremo hay una C). Pfu, Pwo y Tli generan extremos romos

10 DNA molde Puede ser ssdna o dsdna (simple o doble cadena) En general se utilizan cantidades que van desde 10 a 500 ng dependiendo de la naturaleza de la secuencia a amplificar, ADN genómico (1-100 ng) o plasmídico (2-10 ng), representación del gen de interés en el genoma, etc Usualmente se utilizan varios miles de copias, ej: 1µg de humano, 10 ng de levadura, 1 ng de bacteriano DNA circular cerrado es levemente menos efectivo que el DNA lineal Se puede amplificar a partir de una sola molécula de DNA molde, pero las condiciones deben estar muy optimizadas Debe estar completamente desnaturalizado (etapa previa) Calidad del molde (integridad: no fragmentado en trozos más pequeños de lo que queremos amplificar; proceso de extracción: que la muestra no presente agentes que inhiban a la actividad de la polimerasa como trazas de fenol o alcoholes o quelantes como EDTA que reducen la concentración de iones de Mg en la solución)

11 Oligonucleótidos iniciadores (primers, cebadores) Dos oligonucleótidos cebadores simple hebra complementarios a los extremos de la secuencia que se desea amplificar Presentan entre nt de longitud Se conoce su secuencia Es el factor más importante para la eficiencia y la especificidad del proceso Deben estar presentes en exceso (10 13 = 30 ciclos, 1kb) comparado con el DNA molde Requieren de un cuidadoso diseño Solución stock 10 µm, se usan 0,1-1 µm final en cantidad equimolar de cada oligonucleótido

12 Diseño de cebadores Manual o por programas de bioinformática Complementarios a la secuencia deseada Secuencia del oligo: contenido de GC entre 45-55% Tamaño estándar: 18 a 25 nt Extremos 3 de los oligos quedan enfrentados y deben estar bien apareados Evitar formación de estructuras secundarias: dímeros, autocomplementariedad (palíndromos o largos segmentos de polipurinas y polimirimidinas) e intercomplementariedad Agregado de linkers o sitios de restricción

13 Diseño de cebadores Consideraciones sobre la T melting y T annealing Temperatura de melting o fusión es la temperatura a la que la mitad de los oligos se encuentran hibridados y la mitad se encuentran como simple hebra. A mayor contenido GC más alta T m Si los primers se encuentran mal apareados, la amplificación será menos eficiente o puede no funcionar. Los cebadores con T m más altas pueden aparearse inespecíficamente a temperaturas más bajas y el cebador con la T m más baja puede no aparearse a temperaturas más altas Solamente se puede programar una temperatura en el termociclador o equipo de PCR. Si los cebadores poseen diferentes T m se elige como T annealing la más baja

14 Diseño de cebadores Las temperaturas de melting de los oligonucleótidos pueden ser estimadas usando la fórmula de Wallace: T m = 2(A+T) + 4(G+C) T a = T m - 4 (válida para oligos entre bases de rango, sino se usan fórmulas más complejas) Reglas de diseño: Longitud= 18-25bp Contenido de GC entre 45-55% Ambos cebadores deben tener T m similares (no mas de 5 ºC de diferencia entre ambos) Evitar las secuencias repetidas. No deberían presentar estructuras secundarias

15 Evitar secuencias repetidas 1. Caso de extremos 3 repetidos 5 -NNNNNNNNNNNNNNNTATA-3 5 -NNNNNNNNNNNNNNNTATA NNNNNNNNNNNNNNNTATA-3 3 -ATATNNNNNNNNNNNNNNN PCR Dímero del primer

16 Evitar secuencias repetidas 2. Caso de extremos 5 repetidos 5 -TATANNNNNNNNNNNNNNN-3 5 -TATANNNNNNNNNNNNNNN-3 3 -NNNNNNNNNNNNNNNATAT TATANNNNNNNNNNNNNNN PCR No hay extensión

17 Evitar secuencias repetidas 3. Caso de formación de horquillas 5 -NNNNNNNNNNNNNNNGCATGC-3 5 -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3 5 -NNNNNNNNNNNNNNNGCA 3 -CGT PCR Productos de PCR no deseados

18 Temperatura y tiempo de anillado Rango estándar: entre 50 C - 65 C, s Mejoras en la especificidad: Incrementar la temperatura de anillado (incrementos de 2-5 C son recomendados) puesto que reduce las posibilidades de priming no específico y por lo tanto la formación de producto no específico Reducir los tiempos de anillado. Durante el anillado, los primers se hibridan rápidamente. Tiempos muy largos no mejoran normalmente la producción y pueden producir un aumento en el apareamiento inespecífico y así mayores cantidades de productos no específicos

19 Estrategias para lograr una selectiva amplificación en los primeros ciclos evitando el apareamiento inespecífico Hot start disminuye la inespecificidad causada por el anillado y la elongación a bajas T (agregado de la enzima taq polimerasa o el Mg 2+ a altas T ). Exclusión de un reactivo (dntps, taq, Mg 2+, primers) de la mezcla de reacción hasta que la reacción llega a la temperatura de desnaturalización del ciclo 94 C También puede ser con anti-taq (inhibe la actividad de la Taq polimerasa hasta la etapa de desnaturalización) Touchdown PCR (TD-PCR). Es una modificación de la PCR en la cual la temperatura de anillado inicial es mayor que la T m óptima de los primers y la T a es gradualmente reducida en los subsiguientes ciclos hasta que la T a óptima es alcanzada. Una reducción gradual de la temperatura hasta una temperatura más permisiva durante el curso de los ciclos favorece la amplificación del fragmento deseado

20 Iones Mg 2+ Cofactor requerido para las DNA polimerasas Estabiliza el DNA de doble cadena y eleva la T m, es importante para controlar la especificidad de la reacción Mg 2+ bajo, apareamiento más estricto. Pero muy pocos iones Mg 2+ producen un bajo rendimiento de producto de PCR Mg 2+ alto, aumenta el rendimiento de los productos pero favorece la inespecificidad promoviendo la incorporación errónea Exceso de Mg 2+ reduce la fidelidad de las DNA polimerasas y puede causar la generación de productos no deseados (en un gel aparecen como una escalera) Los dntps secuestran iones Mg 2+ (un cambio importante en la concentración de dntps en el buffer puede requerir el ajuste de la concentración de Mg 2+ en la mezcla de reacción) EDTA en el molde puede afectar la concentración de Mg 2+ libre. La Taq polimerasa requiere Mg 2+ libre para su actividad

21 Concentración de Magnesio Se utiliza en una concentración entre 1 y 4 mm La concentración de magnesio afecta los siguientes procesos: hibridación de los cebadores, temperatura de desnaturalización, especificidad del producto, formación de dímeros entre cebadores y la actividad y fidelidad enzimática Alto Mg 2+ : alto rendimiento; productos inespecíficos Bajo Mg 2+ : bajo rendimiento; alta especificidad Mejorar la especificidad: disminuir la concentración. Cuidado: concentraciones inadecuadas de Mg 2+ pueden dar lugar a un más bajo rendimiento Mejorar la eficiencia: aumentar la concentración. Cuidado: exceso de Mg 2+ tiende a causar reacciones no específicas

22 dntps Las concentraciones de los 4 desoxinucleótidos trifosfato (datp, dctp, dttp, dgtp) deben ser iguales de modo que ocurra la incorporación exacta (si un dntp está en una concentración más alta que otro será incorporado preferencialmente) Rango estándar de concentración: µm Las concentraciones de dntps utilizados en una reacción son determinados por la afinidad de la enzima por el sustrato (la Km de la enzima). Usar concentraciones mayores que la Km (Km para los dntps µm) Se preparan soluciones stock (5-10mM) que contienen cantidades equimoleculares de los dntps La concentración de dntps óptima depende de: Longitud del producto (200 µm puede alcanzar a sintetizar 12,5 µg DNA de 400 bp) MgCl 2 Astringencia (exigencias impuestas por el sistema, rigurosidad)

23 dntps Mejorar la eficiencia: para secuencias molde largas, incrementar la cantidad de dntps Mejorar la fidelidad: bajar la concentración dntps pero tener en cuenta la concentración de Mg 2+ que debe ser disminuida en una proporción equimolar (cambio en su concentración afecta la concentración de Mg 2+ disponible ya que el Mg 2+ forma un complejo soluble con los dntps) Mejorar la especificidad: reducir la concentración de dntp pero observar que la concentración de Mg 2+ proporción equimolar se debe bajar en una Alto dntps baja fidelidad alto rendimiento Bajo dntps alta fidelidad bajo rendimiento

24 Buffer de Reacción Proporciona las condiciones de reacción, que son importantes para la actividad de la enzima Por lo general está formado por: 10 mm tris-hcl (ph=8.4) 50 mm KCl 1.5 mm MgCl 2 Adyuvantes o aditivos: pueden ayudar en la práctica a aumentar la especificidad y fidelidad de la reacción en cadena de la polimerasa. El dimetilsulfóxido (DMSO) añadido al buffer de la reacción en un 10% contribuye a la disminución de la estructura secundaria del ADN. También se pueden usar detergentes como el tween 20, laureth 12 (0.1%) o Tritón x10, que ayudan a estabilizar la enzima. Existen también protocolos que incorporan polietilenglicol (PEG), glicerol, formamida, albúmina sérica bovina (BSA), etc, aunque no son imprescindibles Agua de buena calidad (destilada, desionizada y estéril o agua milliq) para completar el volumen final de la reacción

25 Número de ciclos Rango Estándar: ciclos Se necesitan >25 ciclos para amplificar un gen de copia única a partir de DNA genómico de mamífero Pocos ciclos: bajan el rendimiento Muchos ciclos: aumentan la inespecificidad Algunos componentes se tornan limitantes después de 30 ciclos El efecto plateau favorece las amplificaciones inespecíficas por lo que incrementar el n de ciclos no incrementa la especificidad o la eficiencia Mayor a 40 ciclos: se aumenta cantidad y complejidad de los productos no específicos. Mejorar la especificidad: Reducir el número de ciclos

26 Ejemplo de un protocolo de PCR COMPONENTE VOLUMEN (µl) CONCENTRACIÓN FINAL Agua autoclavada y ultra filtrada (ph 7) 20,7 10X Buffer de PCR 2,5 1X Mezcla dntps (25mM de cada nucleótido) 0,2 200 µm (cada nucleótido) Mezcla de primers (25 pmoles/µl cada uno) 0,4 0,4 µm (cada primer) Taq DNA polimerasa (10U/ µl) 0,2 2 U totales en 25 µl Molde DNA genómico (100 ng/ µl) ng totales en 25 µl c.s.p o C 30x o C o C 2 72 o C o C Molde Cebadores Enzima, longitud producto

27 Detección y Análisis de los resultados Línea 1: fragmento de PCR de aproximadamente 1850 pares de bases de longitud. Línea 2 y 4: los fragmentos son de aproximadamente 800 bases de longitud. Línea 3: no hay producto formado, la PCR falló. Línea 5: múltiples bandas son formadas a causa de que uno de los primers se unió a diferentes regiones del molde de DNA.

28 Consideraciones prácticas importantes PCR es una técnica muy sensible: evitar contaminaciones, ya que es posible que cantidades traza de ADN contaminante sirvan de ADN molde (producto no deseado, falsos positivos) 1. Contaminación por arrastre de ADN diana amplificado en PCR anteriores 2. Contaminación cruzada entre muestras, lo que supone la transferencia de ADN diana de una muestra a otra 3. ADN genómico de preparados de muestras anteriores Normas que ayudan a evitar las contaminaciones: Zonas de trabajo exclusivas para PCR, dotadas de su propio material, separadas de los pasos anteriores (extracción de ADN genómico, etc) y posteriores (corrida electroforética de los productos) Uso de guantes por el manipulador Utilización de reactivos y tubos estériles Cuidado en pipeteo del ADN (evitarse la formación de aerosoles) Las mesas y estantes se lavados periódicamente con lavandina al 10 %, seguida de etanol al 70 % y de ser posible tratadas con luz UV Preparación de la mezcla para la PCR (mezcla maestra) Controles: negativo (todos los componentes de la reacción excepto el ADN molde); positivo (material que se haya utilizado con éxito en PCR anteriores)

29 Introducir sitios de restricción mediante PCR Uno distinto en cada extremo: clonado direccional. Ventaja: no se puede ligar sobre sí mismo y entra en la orientación correcta. Hay dos formas de introducir sitios: 1) agregar el sitio en el 5 del primer o 2) agregarlo internamente introduciendo mismatch. 1) Introducir un sitio BamHI (GGATCC) en el 5 del primer Secuencia del gen: 5 CTTCTGCACACAACTGATGTTCACTAGCAACCTC 3 Primer directo o forward: 5 GCGGATCCCTTCTGCACACAACTG 3 24 nt T m 1= 48= Ta1= 44 T m 2= 76 Ta2=72 T m 1= sólo con la parte que hibrida inicialmente; T m 2= con el oligo completo Anillado de la PCR: primeros 5-10 ciclos a 44º, siguientes a 72º 2) Interno: secuencia del gen: 5 CTTCTGCACACAACTGATGTTCACTAGCAACCTC 3 GgA t cc Primer directo: 5 CTTCTGGATCCAACTGATG TTCAC 3 Restar 4º por cada mismatch T m = 70 Ta= 70 12= 58º Hacer la PCR completa con esta temperatura 29

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31 Bibliografía Sambrook & Russel - Molecular Cloning - Vol. 1, 2, 3-3rd edition Chapter 8, , c2000 CSHL Press PCR: Clinical Diagnostics and Research, Rolfs, Schuller, Finckh and Weber-Rolfs, Chapter 1: PCR Principles and Reaction Components, Pag. 1-21, Springer-Verlag.