Bacteriófagos portadores del gen de la Stx 2 en aguas
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- Gerardo Bustamante Acosta
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1 Universidad de Barcelona Departamento de Microbiología Facultad de Biología Bacteriófagos portadores del gen de la Stx 2 en aguas V o B del Director de la tesis Memoria presentada por M a Teresa Muniesa Pérez para optar al grado de Doctor en Biología Dr. Joan Jofre Torroella Barcelona, Julio de 1998 Programa de doctorado: Microbiología Ambiental y Biotecnología Bienio: 94-96
2 Anexos
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4 Anexo 1; Diluyen tes, medios de cultivo y antibióticos Diluyentes Peptona salina - Peptona l g -NaCl 8,5 g - Agua destilada 1000 mi Disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Guardar a temperatura ambiente. Ringer 1/4 - Ringer 2,5 g - Agua destilada 1000 ml Disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Guardar a temperatura ambiente. Medios de cultivo para E. coli Medio de triptona Medio líquido - Triptona 10 g - Glucosa l g -NaCl 5g - Agua destilada 1000 mi Disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Guardar a 4 C hasta su utilización En la utilización de este medio para el crecimiento de la cepa E. coli CN13 se añadió ácido nalidíxico a una concentración de 100 mg /I en el momento de su utilización. Anexo 1 271
5 Agar blando Añadir 7 g/litro de agar bacteriológico a la fórmula del medio, disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Mantener a 55 C durante un máximo de una semana hasta su utilización. En la utilización de este medio para el crecimiento de la cepa E. coli CN13 se añadió ácido nalidíxico a una concentración de 100 mg l\ en el momento de su utilización. Agar para crecimiento en placa Añadir 15 g/litro de agar bacteriológico a la fórmula del medio, disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Preparar las placas y dejar solidificar. Guardar las placas a 4 C hasta su utilización. Medio Scholten's modificado (Havelaar y col., 1983) Medio liquido - Peptona 10g - Extracto de levadura 3g - NaCl 3 g - Extracto de carne 12 g - Solución de magnesio (100g MgCl 2.6H 2 O / 50 mi agua) 0,3 mi -Na 2 CQ } (150g/l) 5 mi - Agua destilada 1000 mi Disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Guardar a 4 C hasta su utilización. En la utilización de este medio para el crecimiento de la cepa E. coli CN13 se añadió ácido nalidíxico a una concentración de 100 mg /I. 272 Anexo 1
6 Agar blando Añadir 7 g/litro de agar bacteriológico a la fórmula del medio, disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Mantener a 55 C durante un máximo de una semana hasta su utilización. En el momento de utilizarlo, añadir 6 mi de la solución de CaCl 2 M estéril por litro de agar blando(*). Asimismo en la utilización de este medio para el crecimiento de la cepa E. coli CN13 se añadió ácido nalidíxico a una concentración de 100 mg /I. Agar para crecimiento en placa Añadir 15 g/litro de agar bacteriológico a la fórmula del medio, disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Añadir 6 mi de la solución de CaCl 2 M estéril por litro de agar para crecimiento en placa. Preparar las placas y dejar solidificar. Guardar las placas a 4 C hasta su utilización. CaCl 2 1 M - CaCl 2 (anhidro) 10,8g - Agua destilada 100 mi Disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. (*) NOTA: El CaCh forma precipitados, por lo que se recomienda su adición al medio de agar blando inmediatamente antes de su utilización. Anexo 1 273
7 Medio de Luria (LB) Medio líquido - Triptona 10 g - Extracto de Levadura 5 g -NaCl 10 g - Agua destilada 1000 mi Disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos LB suplementado con CaCl 2 10 mm - Medio líquido Luria 1000 mi -CaCl 2 1,46 g Disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos Agar blando Añadir 7 g/litro de agar bacteriológico a la fórmula del medio, disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Mantener a 55 C durante un máximo de una semana hasta su utilización. Agar para crecimiento en placa Añadir 15 g/litro de agar bacteriológico a la fórmula del medio, disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Preparar las placas y dejar solidificar. Guardar las placas a 4 C hasta su utilización. 274 Anexo 1
8 Medios utilizados en cultivo celular Medio Eagel's modificado (MEM) MEM 9,4 gr Bicarbonato sódico 7,5% 30 mi Glutamina 200mM 10 mi Penicilina 10 4 unidades/ml/ 10 mi Estreptomicina 10 4 mg/ml 10 mi Suero fetal 10 %, 5 % o 1% (*) Agua destilada 1000 mi Preparar el medio base (MEM), disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Posteriormente añadir los otros componentes en condiciones estériles. Solución fijadora cristal violeta y formol - Cristal violeta - Alcohol isopropílico - Formaldehído al % -Agua U g 50 ml 300ml 650ml Disolver por agitación y guardar a temperatura ambiente Tripsina - Tripsina (Difco) 1:250 1,25 g - Tritiplex (EDTA) 0,1 g - PBS 500 ml - Penicilina:estreptomicina ( 1 OOOOunidades/ml: 1 OOOOug/1) 5 mi Disolver por agitación. Esterilizar por filtración y guardar a 4 C. V (*) NOTA: El porcentaje de Suero fetal depende de si se está preparando el medio para la recuperación de células congeladas (10%), como medio de crecimiento (5%) o como medio de mantenimiento (1%). Anexo 1 275
9 Medio RPMI-1640 para hibridomas -Medio ,4 g - Agua bidestilada 1000 mi Ajustar el ph a 4 con HC1 IN para favorecer la disolución del producto. Una vez disuelto, reajustar el ph a 7,2 con NaOH IN antes de añadir bicarbonato sódico. - Bicarbonato sódico 7,5 %(p/v) 26,7 mi Esterilizar por filtración y guardar a 4 C. Antibióticos Ácido nalidíxico - Ácido nalidíxico l g - NaOH IM 2 mi - Agua destilada 8 mi Disolver el producto en NaOH por agitación. Una vez disuelto, añadir 8 mi de agua destilada. Esterilizar por filtración, alicuotar en tubos de 1,5 mi y guardar a (-20) C. 276 Anexo 1
10 Anexo 2; Tampones y reactivos Tampón Glicina 0,25 M ph 9,5 -Glicina 18,76 g - Agua destilada 1000 mi Disolver por agitación. Ajustar el ph a 9,5 con NaOH 10 M. Esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Tampón Salino-fosfato: PBS (IX) -NaCl 8 g -KC1 0,2 g -Na 2 HP0 4 1,15 g - KH 2 P0 4 0,2 g - Agua destilada 1000 mi Disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. PBS 2X: Se prepara según se ha descrito para el PBS IX, pero disolviendo doble cantidad de cada producto en 1000 mi de agua destilada. Sacarosa 20 % - Sacarosa 20 g - Agua destilada ajustar a 100 ml Disolver por agitación. Esterilizar por filtración. Guardar a 4 C. Preparación membranas de diálisis Tampón de lavado -Na 2 CO 3 20 g - EDTA 0,2 M 5 ml - Agua destilada 995 mi Disolver por agitación. Preparar inmediatamente antes de utilizar. Anexo 2 277
11 Tampon EDTA - EDTA 0,2 M 5 ml - Agua destilada 995 mi Mezclar por agitación. Preparar inmediatamente antes de utilizar. Tampón de diálisis -NaCl 2,94 g - Tris HC1 ph 7,5 lomm 5 mi - MgS0 4 2,48 g - Agua destilada 1000 mi Disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Guardar a 4 C. Tratamiento con ADNasa Tampón para ADNasa - Acetato sódico 5mM 0,0684 g -CaCl 2 lmm 0,011 g - Glicerol 50 mi - Agua bidestilada 50 mi Disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Guardar a 4 C. Electroforesis de ADN TBE10X - Tris base 109 g - Ácido bórico 55,6 g -EDTA 92 g Disolver por agitación en 400 mi de agua bidestilada. Ajustar el ph a 8,3 con NaOH IM. Ajustar el volumen a 1 litro con agua bidestilada. 278 Anexo 2
12 TBE IX y 0,5X (A partir del solución concentrada de TBE 10X) Disolver respectivamente 1/10 o 0,5/10 (v/v) la solución TBE 10X con agua bidestilada estéril. Mezclar por agitación. Preparar inmediatamente antes de utilizar. Agarosa en TBE IX Las soluciones de agarosa dependen del tipo de ADN en estudio y del protocolo utilizado (Tabla 1). Disolver la cantidad de agarosa necesaria en 100 mi de TBE IX (p/v) (Tabla 1) en una botella de vidrio. Agitar manualmente y disolver la agarosa por calor mediante la utilización de un horno microondas, durante aproximadamente 5 minutos a nivel bajo. La agarosa disuelta presenta un aspecto transparente y homogéneo sin grumos. Dejar reposar la agarosa hasta que se enfríe (aproximadamente 50 C). Vertirla sobre la cubeta en el caso de preparación de un gel horizontal o introducirla entre los dos vidrios con la ayuda de una pipeta en el caso de preparación de un gel vertical. Tabla 1.- Porcentajes de agarosa utilizados según el protocolo y el tipo de ADN en estudio. Protocolo Tamaño del ADN % del gel de Cantidad de agarosa agarosa por 100 mi de TBE IX Extracción de ADN Superior a 1 Kb 0,8 % 8 g Electroforesis vertical Variable 1,5 % 1,5 g Primera PCR Entre 1 Kb y 500 pb 2 % 2 g PCR anidada Inferior a 500 pb 3 % 3g Tinción con bromuro de etidio Esta técnica permite visualizar el ADN presente en los gelés de agarosa. Actúa intercalándose entre las dos cadenas de ADN, emitiendo, en este caso, fluorescencia de color rojizo cuando se expone a radiación ultravioleta. Anexo 2 279
13 Solución concentrada (*) - Bromuro de etidio 200 mg - DMSO (Dimetilsulfóxido) 10 mi - Etanol absoluto 90 mi Disolver por agitación. Guardar a 4 C protegido de la luz. La solución se mantiene en estas condiciones durante largo tiempo. Solución de bromuro de etidio 0,5 ug/ml (tinción de gelés de agarosa)(*) - Solución concentrada 50 ^1 - Agua destilada 200 mi Mezclar suavemente por agitación. Guardar a temperatura ambiente protegido de la luz. Se recomienda preparar solución nueva cuando se observe un descenso en la actividad del producto. Extracción y precipitación de ADN EDTA 0,2 M - EDTA 7,44 g - Agua bidestilada 100 mi Disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Guardar a temperatura ambiente. Proteinasa K - Proteinasa K liofilizada.sigma. 10 mg - Agua bidestilada estéril. 1 mi Disolver por agitación en condiciones estériles. Guardar la mezcla a (-20) C hasta su utilización. (*) NOTA: El bromuro de etidio es un potente carcinógeno. Se recomienda manipularlo con precaución. 280
14 SDS 10 % -SDS 10 g - Agua bidestilada 100 mi Disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Guardar a temperatura ambiente. Biofenol (*) El Biofenol viene equilibrado comercialmente a un ph de 8,0. Presenta un color amarillo que permite distinguirlo de la fase acuosa del tampón utilizado para equilibrarlo al ph adecuado. Este tampón es inmiscible en el fenol y se advierten dos fases separadas. Antes de usarlo se recomienda mezclar las dos fases agitando por inversión y dejarlo en reposo hasta que se vuelvan a separar. Guardar a 4 C protegido de la luz. Acetato sódico 3 M - Acetato sódico 41 g - Agua bidestilada 100 mi Ajustar a ph :4,5-5,5 con HC1 35%. Disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Guardar a temperatura ambiente. Fijación de ADN a una membrana SSC 6X - Tampón SSC 20X - Agua bidestilada estéril 33 mi 100 mi Mezclar por agitación y guardar a temperatura ambiente. (*) NOTA: El biofenol es un producto altamente tóxico por inalación y contacto. Se recomienda manipularlo con precaución. Anexo 2 281
15 Bacteriófagos portadores del gen de la Six 2 en aguas Hibridación sonda radiactiva Tampón hibridación sonda radiactiva (Volumen final 7 mi para 1 membrana) -SSC20X 2,1 mi - NaPO 4 IM 140 ni - SDS 10% 0,7ml - Esperma de salmón (lmg/ml)(*) 70 \ú - Reactivo de Denhard's 350 ul - Agua destilada 3,64 mi Mezclar por agitación. Preparar inmediatamente antes de utilizar. Reactivo de Denhard's - Ficoll 10 g - Polivinilpirrolidona 10 g - BSA (Suero de Albúmina bovina) 10 g - Agua destilada 500 mi Disolver por agitación. Esterilizar por filtración y guardarlo alicuotado a (-20) C. Tampón de lavado sonda radiactiva -6XSCC 170 mi -SDS 10% 30 mi - Agua destilada estéril 300 mi Mezclar por agitación y guardar a temperatura ambiente. Hibridación de una sonda marcada con digoxigenina SSC 20X - NaCl 175,3 g - Citrato sódico 88,2 g - Agua bidestilada 1000 mi Disolver por agitación, ajustatel ph a 7,0 y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Guardar a temperatura ambiente. (*) NOTA: Se recomienda hervir 5 minutos el esperma de salmón antes de incorporarlo al tampón. 282 Anexo 2
16 SSC 5X+1%SDS - SSC 20X 125 mi - SDS 10% 5 mi - Agua bidestilada estéril 370 mi Mezclar por agitación y guardar a temperatura ambiente. SSC 2X+1%SDS - SSC 20X - SDS 10% - Agua bidestilada estéril 50 mi 5ml 445 mi Mezclar por agitación y guardar a temperatura ambiente. Tampon de Hibridación - SSC 20X 62,5 mi - Agente bloqueante 50 mi -SarcosillO% 2,5 mi - SDS 10% 0,5 mi - Agua bidestilada 134,5 mi Mezclar por agitación. Preparar inmediatamente antes de utilizar. Agente bloqueante - Agente bloqueante(kit Digoxigenina Boehringer Manheim) 10 g - Tampon #1 100 ml Disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Guardar a 4 C. Tampón # 1 - Ácido Maléico 11,6 g - NaCl 8,8 g - Agua bidestilada 1000 mi Disolver por agitación, ajustar a ph 7,5 y esterilizar a 121 C durante 15 minutos Guardar a 4 C Anexo 2 283
17 Tampón # 2 - Tampón #1 900 mi - Agente bloqueante 100 mi Mezclar por agitación y guardar a 4 C. Tampón #3 - Tris IM ph 8,0 50 mi -NaCISM 10 mi - MgCl 2 IM 25 mi - Agua bidestilada 415 mi Mezclar por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Guardar a 4 C Tampón de lavado - Tween 20 3 mi - Tampón # mi Mezclar por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Guardar a 4 C Detección de la sonda Solución reveladora -Revelador 100 mi - Agua destilada 400 mi Mezclar por agitación. Preparar inmediatamente antes de utilizar. Solución Fijadora - Fijador 100 mi - Agua destilada 400 mi Mezclar por agitación. Preparar inmediatamente antes de utilizar. 284 Anexo 2
18 "Western blot"; Preparación de un gel de poliacrilamida Solución A : Acrilamida-Bis (30 % T- 27 % C) - Acrilamida (*) 29,2g - Bis 0,8 g - Agua destilada 100 mi Disolver por agitación. Guardar a 4 C durante un máximo de 3 meses protegido de la luz. Solución B (Tampon de resolución: 1,5 M Tris-HCl, ph 8,8) -Tris base 18,15g - Agua destilada 100 ml Disolver por agitación. Ajustar el ph con HC1 IN hasta 8,8. Guardar a 4 C. Solución C (Tampon de compactación: 0,5 M Tris-HCl, ph 6,8) - Tris base 6 g - Agua destilada 100 ml Disolver por agitación. Ajustar el ph con HC1 IN hasta 6,8. Guardar a 4 C. Persulfato amónico (APS 10 %) -APS lg - Agua destilada 10 mi Disolver por agitación, alicuotar en microtubos y guardar a (-20) C. V (*) NOTA: La acrilamida es neurotóxica. Se recomienda manipularla con precaución Anexo 2 285
19 Tampón de carga LSB 2X (Laemmli Sample Buffer) (Para un volumen final de 80 ml) - Tris-HCl ph 6,8. 0,5 M 20 ml - Glicerol 16 ml - SDS 10% 32 ml - Azul de bromofenol 0,05 % (p/v) 4 ml - 2- ß-mercaptoetanol 8 ml Mezclar por agitación y guardar a (-20) C. Mezclar el tampon de carga con las muestras que se ptretenden estudiar, en relación 1:1 (v/v). Antes de cargarlas al gel se recomienda hervir las muestras 5-7 minutos (Ver apartado Material y Métodos Capítulo 1). Puesto que el 2-ßmercaptoetanol es un producto muy volátil, otra posibilidad es añadirlo después de hervir la muestra en lugar de incorporarlo inicialmente al tampon de carga. En este caso se añadirán looul de 2- ß-mercaptoetanol por cada mi de LSB 2X. Tampón de recorrido - Tris base 3g - Glicina 14,4 g -SDS l g - Agua destilada 1000 mi Disolver por agitación y guardar a 4 C. Western blot ; Inmunodetección TBS-Tween+3% BSA - TBS-Tween (5X) 100 mi -BSA 15 g - Agua destilada 400 mi Disolver por agitación. Preparar inmediatamente antes de utilizar. 286
20 TBS-Tween 5X - Tris -NaCl - Tween 20 - Agua destilada 6,055 g 40,9 g 5ml 1000 ml Disolver por agitación. Guardar a 4 C. TBS-Tween IX - TBS-Tween 5X - Agua destilada 100 mi 400 mi Mezclar por agitación. Preparar inmediatamente antes de utilizar. Tampón base número 3 (5X). - Tris-HCl IM ph 9,6 -NaCl 250 mi 2,922 g Disolver por agitación. Guardar a 4 C. Tris-HCl IM ph 9,6 - Tris - Agua destilada 60,57 g 500ml Ajustar el ph con HCl hasta ph 9,6. Disolver por agitación y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Guardar a temperatura ambiente. Tampón para inmunodetección número 3 - Tampón base número 3 - MgCl 2 2M (40X) - Agua destilada 2 mi 250nl 10 mi Mezclar por agitación. Preparar inmediatamente antes de utilizar. Anexo 2 287
21 Microscopía electrónica Ácido fosfotúngstico 2% KOH, ph 7,2 - Ácido fosfotúngstico 2 g - Solución KOH O, l M 100 ml Ajustar el ph con KOH IM a 7,2. Disolver por agitación y esterilizar por filtración (*). Guardar a temperatura ambiente. (*) NOTA: Se recomienda volver a filtrar antes de su utilización, dado que tiende a formar precipitados. 2gg Anexo 2
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B) Añadir al medio LB, además de la ampicilina, el IPTG (conc final, 0.5 mm) y X-Gal (conc. final 80 µg/ml). Es decir, para 100 ml de LB adicionar:
Medios utilizados en este apartado: 1.-IPTG stock solution (0.1 M) - 0.6 g IPTG. - Añadir agua estéril a un volumen final de 25 ml. Filtrar con papel secante pasando la solución a tubos eurotubos. Guardar
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