PRÁCTICA 1 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRE, REGULADORES DE CRECIMIENTO Y MEDIOS DE CULTIVO

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1 PRÁCTICA 1 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRE, REGULADORES DE CRECIMIENTO Y MEDIOS DE CULTIVO Objetivos Conocer las instalaciones y el equipo del Laboratorio de Biotecnología de Plantas, así como su correcto funcionamiento. Aprender sobre la preparación de soluciones madre, reguladores de crecimiento y medios de cultivo. Procedimiento Preparación de soluciones madre Macroelementos (según el medio de cultivo Murashige y Skoog 1962) 1. Para preparar una solución 10X (que será 10 veces más concentrada) multiplique por 10 la cantidad indicada para cada uno de los macroelementos (Ver Cuadro 1). NH 4 NO 3 : 1650 mg*10: mg 2. Pese cada uno de los macroelementos por separado. 3. En un balón aforado de 1000 ml, agregue 500 ml de agua destilada y adicione uno a uno las cantidades pesadas de los macroelementos. NOTA: Espere a que se disuelva cada macroelemento antes de adicionar el siguiente. 4. Agite y afore a 1000 ml con agua destilada. 5. Transfiera la solución de macroelementos a una botella para su almacenamiento. 6. Rotule la botella con el nombre de la solución (Macroelementos 10X), fecha y nombre de la persona que lo 7. Para recordar la cantidad de solución madre de macroelementos que se debe de adicionar por litro de medio de cultivo: 1000 ml/10x: 100 ml de la solución madre por litro de medio de cultivo. Microelementos (según el medio de cultivo Murashige y Skoog 1962) 1. Para preparar una solución 200X (que será 200 veces más concentrada) multiplique por 200 la cantidad indicada para cada uno de los microelementos (Ver Cuadro 1). H 3 BO 3 : 6.2 mg*200: 1240 mg 2. Pese cada uno de los microelementos por separado. 3. En un balón aforado de 1000 ml, agregue 500 ml de agua destilada y adicione uno a uno las cantidades pesadas de los microelementos. NOTA: Espere a que se disuelva cada microelemento antes de adicionar el siguiente. 4. Agite y afore a 1000 ml con agua destilada. 5. Transfiera la solución de microelementos a una botella para su almacenamiento. 6. Rotule la botella con el nombre de la solución (Microelementos 200X), fecha y nombre de la persona que lo 7. Para recordar la cantidad de solución madre de microelementos que se debe de adicionar por litro de medio de cultivo: 1000 ml/200x: 5 ml de la solución madre por litro de medio de cultivo. Vitaminas (según el medio de cultivo Murashige y Skoog 1962) 1. Cada vitamina se prepara por separado. 2. Pese 50 mg de ácido nicotínico, piridoxina y tiamina por separado. 3. En un balón aforado de 100 ml, agregue 50 ml de agua destilada y adicione la cantidad pesada de la vitamina. 8. Transfiera la solución de cada vitamina a una botella para su almacenamiento. 4. Rotule la botella con el nombre de la solución, concentración, fecha y nombre de la persona que lo 5. NOTA: El mio-inositol se pesa y se agrega a la hora de preparar el medio de cultivo.

2 Hierro 1. Tome un beaker de 1000 ml y agregue 700 ml de agua destilada. Introduzca una pastilla magnética y coloque el recipiente sobre un calentador. 2. Cuando el agua está hirviendo agregue la cantidad pesada de hierro (Ver Cuadro 1). 3. Coloque el beaker en un lugar oscuro y cuando este frío transfiera la solución a un balón aforado y agregue agua hasta la marca de aforo. 4. Transfiera la solución de hierro a una botella ambar para su almacenamiento. 5. Rotule la botella con la nombre de la solución, concentración, fecha y nombre de la persona que lo Reguladores de crecimiento 1. Cada reguladores de crecimiento se prepara por separado. 2. Pese 50 mg de cada uno de los reguladores de crecimiento por separado (Ver Cuadro 3). 3. En un balón aforado de 50 ml, agregue 25 ml de agua destilada y adicione la cantidad pesada de los reguladores de crecimiento. 4. Transfiera la solución de cada reguladores de crecimiento a una botella para su almacenamiento. 5. Rotule la botella con el nombre de la solución, concentración, fecha y nombre de la persona que lo Preparación de medios de cultivo 1. Tome un beaker de 1000 ml y agregue 250 ml de agua destilada. Introduzca una pastilla magnética y coloque el recipiente sobre un agitador magnético. 2. Agregar 30 g de sacarosa y las alícuotas de las soluciones madre de macroelementos, microelementos, vitaminas, hierro y reguladores de crecimiento (Ver Cuadro 2). 3. Agregue agua destilada al beaker sin llegar a la marca de los 1000 ml. 4. Mida el ph del medio de cultivo utilizando un phmetro. 5. Afore el medio de cultivo a 1000 ml. 6. Pese y agregue el gelificante. 7. Antes de dispensar el medio de cultivo en frascos Gerber debe de calentarlo en el microondas por 6-7 minutos. 8. Esterilizar el medio de cultivo en una autoclave a 121 C por 21 minutos. 9. Si el medio de cultivo contiene sustancias lábiles al calor (que se puedan degradar) después de autoclavado en la cámara de flujo laminar permita que el medio se enfrie. Una vez frío agregue la sustancia previamente esterilizada mediante filtración (Milipore 0.22 µm). Unidades para la preparación de medios de cultivo Concentración molar 1 M: el peso molecular en gl -1 1 mm: el peso molecular en mgl -1 ó 10-3 M 1 µm: el peso molecular en µgl -1 ó 10-6 M ó o 10-3 mm Conversión de mgl -1 a mili molar No. mg CaCl 2 2H 2 O/peso molecular CaCl 2 2H 2 O = 440 mg/ = mm Conversión de mili molar a mgl -1 2,4-D: peso molecular M 2,4-D: gl -1 1 mm 2,4-D: mgl -1 = gl -1 1 µm 2,4-D: µgl -1 = mgl -1 Conversión de micro molar a mgl -1 (µm * peso molecular)/10 6 =mgl -1

3 Cuadro 1. Preparación de las soluciones madre para el medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) (MS). Componente Concentración en el medio MS (mgl -1 ) Concentración en la solución madre (mgl -1 ) Pesar (g) para 1 litro Macroelementos (10X) NH 4 NO KNO CaCl 2 2H 2 O MgSO 4 7 H 2 O KH 2 PO Microelementos (200X) H 3 BO MnSO 4. 4H 2 O ZnSO 4. 7H 2 O KI Na 2 MoO 4. 2 H 2 O CoCl 2. 6H 2 O CuSO 4.5H 2 O Hierro (100X) EDTANaFeO Vitaminas (200X) Ácido nicotínico Piridoxina Tiamina Myo-inositol Otros Glicina * Sacarosa Añadir fresco 30 Agar 8000 Añadir fresco 8 * Pesar 50 mg y disolver en 100 ml de agua destilada. Cuadro 2. Cantidad de los componentes del medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) necesarias para preparar 1 L de medio de cultivo. Componente Concentración Cantidad a utilizar para 1 L de medio de cultivo Macroelementos 10X 100 ml Microelementos 100X 10 ml Fe-EDTA 100X 10 ml Tiamina 0.5 mgml ml Ácido nicotínico 0.5 mgml -1 1 ml Piridoxina 0.5 mgml -1 1 ml Glicina 0.5 mgml -1 4 ml Inositol mg Sacarosa - 30 g Agar - 8 g ph - 5.6

4 Cuadro 3. Características de los principales reguladores de crecimiento utilizados en cultivo de tejidos. Regulador de crecimiento Abreviación Peso molecular Solubilidad Ácido 2,4-diclorofenoxiacético 2,4-D Etanol 95% Ácido 3-indolacético AIA N NaOH Etanol 95% Ácido 3-indolbutírico AIB N NaOH Etanol 95% Ácido naftalenacético ANA N NaOH Etanol 95% Adenina A H 2 O Sulfato de adenina AS H 2 O 6- Bencilaminopurina BAP N NaOH 2-isopenteniladenina 2-Ip N NaOH Kinetina Kin N NaOH Zeatina Z N NaOH - 1 N HCl Ácido giberélico AG Etanol Ácido abscísico ABA N NaOH Si necesita cambiar un compuesto con un número de hidratación por otro, como por ejemplo MnSO 4. 4H 2 O (PM 1 : ) por MnSO 4. H 2 O (PM 2 : ) M 2 : (M 1 *PM 2 )/PM 1 En donde: M 1 : es la masa requerida del compuesto químico original M 2 : es la masa requerida del compuesto químico sustituto PM 1 : es el peso molecular del compuesto químico original PM 2 : es el peso molecular del compuesto químico sustituto

5 HOJA CONTROL PREPARACIÓN MEDIOS DE CULTIVO Preparado por: Fecha: Cultivo: Etapa: Concentración Cantidad a utilizar por 1L ( ) L Macroelementos MS 10X 100 ml Microelementos MS 100X 10 ml Tiamina 0.5 mgml ml Ácido nicotínico 0.5 mgml -1 1 ml Piridoxina 0.5 mgml -1 1 ml Na-Fe EDTA 100X 10 ml Sacarosa 30 g Reguladores de crecimiento Otros Glicina 0.5 mgml -1 4 ml Gelificante ph