Cultivo in vitro. Definición

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1 Definición Cultivo sobre un medio nutritivo, en condiciones estériles, de plantas, semillas, embriones, órganos, tejidos, células y protoplastos, debido a la propiedad de totipotencia de las células vegetales cada una de las células de un individuo vegetal posee la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y desarrollo de un nuevo individuo Las técnicas de cultivo in vitro 1. Ocurren a microescala 2. Se optimizan las condiciones ambientales 3. Se excluyen microorganismos y plagas de plantas 4. A veces no se reproduce un patrón normal dando lugar a callos

2 ETAPAS DEL CULTIVO IN VITRO 1. ELECCIÓN DEL EXPLANTE 2. PREPARACIÓN MEDIO DE CULTIVO 3. DESINFECCIÓN EXPLANTE, MEDIO Y MATERIALES 4. CULTIVO DEL EXPLANTE EN SU MEDIO EN CONDICIONES DE ASÉPSIA 5. DESARROLLO DEL CULTIVO EN CÁMARA EN CONDICIONES DETERMINADAS

3 ELECCIÓN DEL EXPLANTE Células, tejidos o protoplastos Meristemos y embriones Cualquier otro órgano: entrenudos, nudos, raíces, cotiledones, anteras, discos de hoja...etc Elección - Depende de: - Objeto del cultivo: Estudios básicos, sanidad, micropropagación, híbridos interespecíficos, plantas haploides, variación somaclonal, híbridos somáticos, conservación de germoplasma - Posibilidad de contaminación - Edad fisiológica - Tamaño - Época del año

4 ASEPSIA Conocer el material Preparación de la planta Desinfección de explantes Medios e instrumentos esterilizados Cultivar en cámara de flujo laminar

5 Medio de Cultivo El crecimiento y desarrollo de una planta está determinado por una serie de factores: La constitución genética de la planta, cada planta tiene una constitución genética y su expresión depende también de las condiciones físicas y químicas que se crean in vitro Los nutrientes: Agua, macro y microelementos, esenciales para el crecimiento de la planta y azúcares, ya que los explantes no son completamente autotróficos en condiciones in vitro Los factores físicos ambientales: Luz, temperatura, humedad, de gran importancia en el crecimiento y desarrollo in vivo e in vitro. Influyen en todo tipo de procesos: absorción de agua, respiración, fotosíntesis, evaporación, crecimiento, cuajado,... Sustancias orgánicas, reguladores, responsables de la división celular, crecimiento celular,...

6 Los requerimientos para un crecimiento in vitro óptimo varían con la especie, con la parte de la planta que se esté cultivando y a la respuesta que se desea obtener. Debido a estas necesidades específicas se han desarrollado muchas formulaciones para los medios de cultivo. - MS (Murashige and Skoog, 1962) - B5 ( Gamborg et al, 1968) - WPM, 1980

7 MEDIOS DE CULTIVO Una fuente de carbono: Sacarosa Nutrientes minerales Macronutrientes: N, P, K, Ca, Mg, S Micronutrientes: Fe, Zn, B, Mn, Cu, Co, Ni, Al, Mo, I. Vitaminas : Preferente grupo B Reguladores de crecimiento: Auxinas y citoquininas, raro giberelinas Agentes gelificantes: Agar Otros compuestos Agua: (95%) ph de 5 a 6,5

8 Medios de Cultivos Compuestos inorgánicos Macronutrientes: N, P, K, Ca, Mg,.. Micronutrientes: Fe, Cu, Zn, Mn, Co,.. Soporte inerte Agar Componentes orgánicos Carbohidratos: azúcares Vitaminas: piridoxina, tiamina, Reguladores de crecimiento: auxinas, giberelinas, citoquininas,.. Productos orgánicos estimulantes: extracto de levadura, leche de coco, hidrolizado de caseína,

9 Auxinas Cultivo in vitro Las más comúnmente utilizadas son son: IAA (ácido indolacético), IBA (ácido indol-3-butírico), NAA (ácido naftalenacético) y 2,4-D (ácido diclorofenoxiacético En cultivo in vitro las auxinas son utilizadas principalmente para la diferenciación de raíces y la inducción de callo (el 2,4-D es muy efectivo) Sus acciones fisiológicas son: Elongación celular Formación de raíces adventicias Expansión de tejidos Inhibición de la formación de vastagos División celular Embriogénesis en los cultivos en suspensión Formación de callos Bajas concentraciones producen raíces adventicias, altas concentraciones inhiben la producción de raíces y muy altas concentración producen callos. Se utilizan en concentraciones de 0,01-10 mg/l.

10 Citoquininas Cultivo in vitro Las más comúnmente utilizadas son: Kinetina, BAP (bencilamino purina), 2 ip (isopentenil-adenina). promueven la división celular y la inducción de yemas adventicias Además se usan estos compuestos para la proliferación de tallos axilares por la ruptura de la dominancia apical. Sus acciones fisiológicas son: Estimulan el crecimiento, la división celular Formación de vástagos axilares Disminuyen la dominancia apical Retardan el envejecimiento Se utilizan en concentraciones de 1-10 mg/l

11 Giberelinas Existen multitud de giberelinas conocidas. La de mayor uso es el GA3, se utilizan raramente. La mayoría de los explantos sintetizan cantidades suficientes de este grupo de hormonas. Cuando se aportan giberelinas al medio de cultivo, su función principal es el alargamiento de las regiones subapicales. El GA3 es soluble en agua fría hasta 1000 mg/l. Sus acciones fisiológicas son: Elongación de entrenudos Crecimiento de meristemos Crecimiento de yemas in vitro Rotura de dormición de embriones y yemas Inhiben la formación de yemas adventicias.

12 Acido abcísico El ácido absícico (ABA) en la mayor parte de los casos produce un efecto negativo en los cultivos in vitro, pero en determinados casos promueve la maduración de embriones, y en cultivos de células en suspensión facilita la sincronización de la división celular.

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15 Condiciones ambientales para la incubación Horas de luz / oscuridad Temperatura Control de la humedad (aparición de hongos)

16 Aclimatación de las plantas regeneradas in vitro Cultivo in vitro

17 Etapas de la regeneración In vitro de plantas de tomate a- Explantes de hojas de Cotiledones. b- Formación n de callo c-formación n de brotes d-plántulas en medio de enraizamiento e-plántulas enraizadas f-plántulas en suelo estéril g-plantas regeneradas

18 Tipos de cultivo y aplicaciones CULTIVO DE EMBRIONES Eliminar inhibición de germinación Acortamiento del ciclo de mejora Prevención de aborto embrionario Producción de haploides CULTIVO DE SEMILLAS Acortamiento del ciclo de mejora CULTIVO DE MERISTEMOS Eliminación de patógenos (virus, hongos, bacterias) Clonado de plantas Almacenamiento de plantas libre de enfermedades Conservación de germoplasma

19 Tipos de cultivo y aplicaciones CULTIVO DE ANTERAS Y MICROESPORAS Producción de haploides para la obtención de homocigotos Material inicial para la inducción de mutaciones CULTIVO DE OVULOS Y FLORES EXPLANTADAS Superación de incompatibilidades Prevención de la abscisión precoz en flores Consecución de fertilización en tubos de ensayo CULTIVO DE PROTOPLASTOS Hibridación somática Creación de híbridos Estudio de transformaciones

20 Organogénesis o embriogénesis directa Explante DIFERENCIACION EMBRIOGÉNESIS DIRECTA ORGANOGENESIS DIRECTA Embriones Tallos, raíces, hojas Planta completa

21 Organogénesis o embriogénesis indirecta Explante DESDIFERENCIACIÓN CALLO DIFERENCIACION EMBRIOGÉNESIS Embriones Planta completa ORGANOGENESIS Tallos, raíces, hojas

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