Cultivo in vitro: propagación de plantas

Transcripción

1 Cultivo in vitro: propagación de plantas Hojas de enraizando crisantemo Plántula de crisantemo en envase Magenta Un cultivo in vitro es aquel realizado sobre un medio nutritivo en condiciones estériles. Puede ser de: plantas, semillas, embriones, órganos, explantos, células y protoplástos.

2 Características del cultivo in vitro: Es empleado a microescala Hay optimización de las condiciones ambientales No se produce el patrón normal de desarrollo de una planta Hace factible la manipulación de las célula individuales o tejidos. Fundamental para transformación genética.

3 Pioneros del Cultivo in vitro

4 Tipos de Cultivo in vitro. Propagación y regeneración de plantas Plantas regeneradas ORGANOGÉNESIS EMBRIOGÉNESIS Callos Suspensión de células Protoplastos Explantos: trozos hojas, tallos, meristemos, etc. Planta donante Microesporas/gametos

5 Callos Suspensión de células Protoplastos Explantos: trozos hojas, tallos, meristemos, etc. Microesporas/gametos

6 Condiciones de los cultivos in vitro ESTERILIDAD!!

7 Esterilización del material vegetal Se emplean medios nutritivos muy ricos, por lo que la esterilización de todo el material es esencial

8 TOTIPOTENCIA Capacidad de las células vegetales de regenerar un organismo completo. REPROGRAMACIÓN DESARROLLO Se altera el patrón de células que estaban completamente diferenciadas. COMPETENTES No todas las células que responden al cambio de programa de desarrollo.

9 Diferenciación Cambios de forma y función de orgánulos, células y tejidos DESARROLLO Morfogénesis Organización de la estructura de tejidos y órganos. Arquitectura y simetría de la planta Crecimiento Incremento biomasa por división y elongación celular

10 Microescala

11 Auxinas Se transporta polarmente desde el ápice de parte aérea o raíz. El transporte de larga distancia se produce por el floema. Junto con las citoquininas son esenciales para la viabilidad de las plantas: no hay mutantes deficientes. La estructura química de las auxinas es diversa. Pueden acumularse en formas inactivas conjugadas a oligosacáridos y aminoácidos.

12 Auxinas naturales encontradas en plantas Auxinas sintetizadas químicamente

13 Proliferación de raíces secundarias Control Alta [auxina] [Auxina] > 10-8 M causa el inicio de divisiones celulares en el periciclo. Regeneración de plantas favoreciendo el enraizamiento

14 Interacción con citoquinina y ácido abscísico en la dominancia apical de tallo Escisión del ápice causa proliferación de tallos axilares La auxina está implicada en la redistribución de las citoquininas sintetizadas en la raíz hacia el ápice. Escisión del ápice: mayor nivel de citoquinina en las yemas laterales. El ácido abscísico se acumula en las yemas laterales latentes. La escisión del ápice disminuye su contenido.

15 Citoquininas: descubiertas en cultivos in vitro Las se descubrieron al buscar factores que indujeran divisiones celulares y promoviesen el crecimiento de material vegetal. Se probaron multitud de substancias: extractos de levadura, jugo de tomate, etc. La leche de coco (rica en zeatina) fue muy efectiva, más en conjunción con auxina Skoog descubrió que DNA desnaturalizado de esperma de arenque era muy efectivo en promover división celular La kinetina fue la primera citoquinina identificada producida de síntesis por la degradación térmica de DNA

16 Diferentes tipos de citoquininas Sintética Natural Sintética Bencilamino purina (BAP)

17 Producción de callos por acumulación de citoquininas: Agrobacterium CALLO tejido desdiferenciado continua división. en AGALLA tumor producido por la infección de Agrobacterium tumefaciens por acumulación de citoquininas y auxinas

18 En la infección, se produce la inserción de genes bacterianos en el genoma de la célula vegetal, portados en el T-DNA. Éstos codifican enzimas para la síntesis de dichas fitohormonas.

19 Proliferación de parte aérea Control + Citoquinina

20 Distintas moléculas tienen diferente actividad Auxinas y citoquininas tienen diferente nivel de actividad biológica según la molécula empleada: establecer la dosis.

21 Regeneración por organogénesis Concentración de IAA (mg/l) 0 0,005 0,03 0,18 1,18 3,0 Concentración de kinetina (mg/l) 1,0 0,2 0 HOJA CALLO RAÍZ

22 Regeneración de plantas por organogénesis El callo se somete a una relación auxina/citoquinina baja, para inducir la formación de parte aérea. En condiciones de esterilidad, se secciona la parte aérea formada. Se transplanta a un medio de cultivo con una relación auxina/citoquinina alta, para inducir la formación de raíces. Una vez generadas raíces, se transfieren a un sustrato con alta capacidad de retención de agua (p. ej. turba). Las plántulas se cultivan en condiciones de humedad óptima para evitar su desecación, hasta que la raíz se afianza.

23 Protoplastos Obtención enzimática

24 Diversos materiales se pueden incorporar a un protoplasto: orgánulos, DNA plasmídico, bacterias, etc.

25 Variación somaclonal

26 Perjudicial: indeseable en la generación de plantas transgénicas Beneficiosa

27 Transformación de plantas: Agrobacterium Inserción del T-DNA con oncogenes y genes de metabolismo de opinas

28 Pioneros del desarrollo de vectores de transformación basados en Agrobacterium Jeff Schell Mark Van Montagu

29 Plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens

30 Estructura general del T-DNA LB RB

31 Genes vir NO se transfieren

32 SELECCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS

33 Selección de trasngénicos con kanamicina

34 Sólo unas pocas células son transgénicas: varios pasos de selección

35 Vectores binarios desarmados derivados del plásmido Ti de A. tumefaciens

36 LB Nos T MnSOD 35S 35S nptii 35S T RB Cebadores específicos utilizados Fragmento Rubisco (349 pb) nptii (317 pb) 35S (234 pb) Nos term (127 pb) Cebador positivo tccctgtttcaaggaagc Rbcs01F gaagagcatcaggggctc nptii01f tgccatcattgcgataaagg 35S01F gaatcctgttgccggtcttgcg nos01f Cebador negativo gtcgcataaaattgaaggag Rbcs02R gaagaactcgtcaagaaggc nptii02r cctctccaaatgaaatgaac 35S02R gcgggactctaatcataaaaac nos02r

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