Revista Electrónica Granma Ciencia. Vol.14, No.1 Enero-Abril 2010 ISSN X

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1 Revista Electrónica Granma Ciencia. Vol.14, No.1 Enero-Abril 2010 ISSN X Título: Desinfección de semillas maduras de maíz (Zea mays L.) para su establecimiento in vitro y caracterización de hongos contaminantes. Autores: Yarelis Álvarez Morales Juan José Silva Pupo Yosvel Viera Tamayo Enrique Troyo Diéguez Institución: Universidad de Granma. Apartado 21. Bayamo, Granma, Cuba. yalvarezm@udg.co.cu RESUMEN La investigación se realizó en el Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal de la Universidad de Granma. Se evaluaron cinco tratamientos para la desinfección de semillas maduras de maíz, empleándose hipoclorito de sodio, bicloruro de mercurio y sulfato de cobre en diferentes concentraciones y tiempos de aplicación en semillas de las variedades Gibara y Tayuyo. La siembra se realizó en medio de cultivo con las sales MS suplementadas con sacarosa 30 g/l y agar 6 g/l y un ph de 5,7. Se evaluó el porcentaje de desinfección, contaminación por hongos y bacterias y el porcentaje de germinación de las semillas. La combinación del hipoclorito de sodio 1% y cloruro de mercurio 0.1% (T3), así como el empleo combinado del sulfato de cobre 2% y el hipoclorito de sodio 1% (T5), resultaron los mejores tratamientos, pues con ellos se alcanzaron los mejores porcentajes de desinfección en ambas variedades. La variedad Gibara mostró los mejores resultados en la desinfección y germinación de las semillas. La caracterización macro y micromorfológica de las colonias fúngicas aisladas permitió identificar dos géneros de hongos causantes de la contaminación durante la desinfección de las semillas de maíz. Por lo que, basado en el Manual Ilustrado de Barnett y Hunter, (1972), se realizó la caracterización de los hongos contaminantes, según la fase imperfecta de estos, llegando solamente hasta la taxa género. Palabras clave: MAÍZ, SEMILLAS, HONGOS CONTAMINANTES, CULTIVO IN VITRO. INTRODUCCIÓN Las aplicaciones de los métodos biotecnológicos en el cultivo del maíz están dirigidas fundamentalmente al mejoramiento genético mediante el empleo de la variación somaclonal y la selección in vitro, así como la transformación de plantas con la inserción de genes que brinden resistencia a factores bióticos, abióticos y el mejoramiento de la calidad nutritiva del cultivo (Borras [et al.], 2004).

2 El mejoramiento genético para los cultivos más importantes constituye una vía estratégica para la alimentación de la población, en un mundo donde escasean cada vez más los alimentos, lo que constituye un medio de influencia política y comercial. (Cornide, 2002). Según Skirvin [et al.], (1999), las técnicas de cultivo de tejidos, no solo requieren un ambiente de trabajo aséptico, sino también que los materiales a emplear se encuentren libres de contaminantes. Los hongos y las bacterias son los contaminantes más comunes que afectan el trabajo in vitro, por lo que a pesar de la esmerada atención que se le brinda a la esterilización en dicha técnica, la contaminación por la presencia de estos microorganismos en los explantes puede causar hasta el 100% de las pérdidas. Uno de los primeros pasos para el proceso de transformación genética en las plantas es adquirir el material estéril. Para el establecimiento in vitro del maíz, existe un protocolo para la esterilización del material inicial cuando se usan embriones inmaduros, propuesto por Frame [et al.], (2006), sin embargo no se ha informado de un protocolo efectivo para las semillas maduras, por lo que se hace difícil el trabajo con este tipo de explante. Esta investigación tuvo como objetivo, determinar el tratamiento más eficiente para la desinfección de semillas de maíz para su establecimiento in vitro, así como caracterizar los principales microorganismos contaminantes. MATERIALES Y MÉTODOS Se emplearon semillas de maíz de la variedad Gibara y Tayuyo, suministradas por la Estación Territorial de Investigaciones Agropecuarias de Holguín (ETIAH). Se utilizaron un total de 50 semillas por tratamiento, las cuales fueron previamente tratadas con el siguiente procedimiento. - Lavado de las semillas con agua destilada y detergente comercial en agitación durante 20 minutos. - Lavado con agua corriente hasta eliminar el detergente. Posteriormente un nuevo lavado con agua destilada estéril. - Aplicar el tratamiento correspondiente de desinfección en el flujo laminar. - Siembra en los tubos de ensayo a razón de una semilla por tubo de ensayo con 10 ml del medio de cultivo. Medio de cultivo empleado: Sales Murashige-Skoog, (1962) al 100%, Sacarosa 30 g.l -1, Agar 6 g.l -1, ph 5,7. En todos los tratamientos se utilizaron tubos de ensayo con 10 ml de medio de cultivo. La incubación se realizó en condiciones de luz natural y temperatura de 27 grados Celsius. Tratamientos evaluados: Se aplicó hipoclorito de sodio al 1% durante 20 minutos, luego se lavaron las semillas 4 veces con agua destilada estéril, se mantuvieron tapadas en el flujo laminar durante 24 horas. Una vez concluido el tiempo de reposo se le aplicó nuevamente el mismo tratamiento y finalmente se procedió a la siembra. Se trataron las semillas con hipoclorito de sodio al 1% durante 20 minutos, posteriormente se lavaron con agua destilada estéril 4 veces, se mantuvieron tapadas en el flujo laminar durante 24 horas. Luego se

3 trataron con sulfato de cobre al 2% durante 1 hora, se lavaron con agua destilada estéril hasta eliminar la sustancia y se procedió a la siembra. El tratamiento inicial se realizó con hipoclorito de sodio al 1% durante 20 minutos, luego se lavaron las semillas 4 veces con agua destilada estéril, se mantuvieron tapadas en el flujo laminar durante 24 horas y luego se le aplicó una solución de Cloruro de mercurio al 0,1% durante 10 minutos, se lavaron las semillas 4 veces y se llevó a cabo la siembra. Se trataron las semillas con sulfato de cobre al 2% durante 1 hora. Luego se le retiró la sustancia y se procedió directamente a la siembra sin lavar las semillas. Se trataron las semillas con sulfato de cobre al 2% durante 1 hora, luego se eliminó la solución lavando 4 veces las semillas con agua destilada estéril, se mantuvieron 24 horas en el flujo laminar, se trataron entonces durante 20 minutos con hipoclorito de sodio al 1%, se lavaron las semillas con agua destilada estéril y se realizó la siembra. Variables evaluadas: Semillas desinfectadas (%). Se determinó a los siete días a partir del número de semillas por tratamiento donde no se apreció la presencia de microorganismos contaminantes. Semillas contaminadas por hongos (%). Se determinó a los siete días a partir del número de muestra por tratamientos contaminados por hongos. Semillas contaminadas por bacterias (%). Se determinó a los siete días a partir del número de muestra por tratamientos contaminados por bacterias. Germinación (%). Se determinó a los tres días a partir de las semillas que mostraron emisión de raíces. Se empleó un diseño completamente aleatorizado y los datos se procesaron mediante un análisis de comparación de proporciones según el paquete estadístico STATISTICA 6.1. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La combinación de hipoclorito de sodio con el cloruro de mercurio (T3) resultó el tratamiento más eficiente al obtenerse el mejor porcentaje de desinfección de las semillas con valor de 84 % mostrando diferencias significativas en relación con los tratamientos T1 y T4 donde fue más bajo el porcentaje de desinfección. Los tratamientos T5 y T2 no mostraron diferencias significativas con respecto al T3 por lo que se puede plantear que estos tratamientos fueron los más efectivos en la desinfección de las semillas de esta variedad. Estos resultados demuestran las potencialidades del empleo combinado del Hipoclorito de sodio y el cloruro de mercurio para la eliminación de microorganismos, principalmente hongos que se encuentran alojados en los intersticios de los explantes y resultan difíciles de eliminar con el uso de un solo agente desinfectante. En estudios realizados con anterioridad, no se logró la eliminación de los hongos con la aplicación del hipoclorito de sodio al 1 y 2% durante 10, 20 y 30 minutos. Skirvin [et al.], (1999) señalaron que la desinfección superficial de los explantes puede realizarse con el hipoclorito de sodio, hipoclorito de calcio, alcohol y

4 peróxido de hidrógeno, siendo el hipoclorito de sodio el agente desinfectante más comúnmente empleado; expresaron además que el bicloruro de mercurio puede ser empleado, pero el mismo no se recomienda debido a su toxicidad, sin embargo, esta respuesta sugiere que la acción del cloruro de mercurio como agente desinfectante, propició un mejor contacto con los microorganismos contaminantes, que puedan encontrarse en la superficie o tejidos del explante, cuya presencia puede ser debido a la contaminación ambiental. Durante el proceso de establecimiento del cultivo in Vitro de plantas, la desinfección es un aspecto indispensable y puede resultar bastante complicada la eliminación de los microorganismos, fundamentalmente cuando el material procede de condiciones de campo. Durante la investigación se reveló que en esta variedad, el porcentaje de semillas contaminadas por bacterias fue similar en todos los tratamientos y de acuerdo con los porcentajes obtenidos se infiere que los tratamientos de desinfección empleados para reducir las pérdida por esta vía son efectivos ya que no se observaron diferencias significativas entre los tratamientos. Las bacterias crecieron superficialmente en el medio de cultivo y alrededor de los explantes, lo que coincide con lo planteado por Alvarado, (1998). Con relación a las semillas contaminadas por hongos, una vez aplicados los tratamientos de desinfección se observó que el mayor porcentaje de contaminación se obtuvo en el T1 el cual difiere significativamente del T3 al obtenerse en este la mejor respuesta. Todo indica que el hipoclorito de sodio combinado con bicloruro de mercurio redujo en gran medida la afectación por hongos en esta variedad al obtenerse el más bajo porcentaje de contaminación. Como ha sido anunciado por algunos autores (Skirvin [et al.], 1999), la contaminación por hongos es uno de las factores que más afecta el éxito del trabajo in vitro por lo que su control resulta indispensable para reducir las pérdidas en este sentido. La germinación de las semillas en el medio se evaluó a partir de la emisión de la ridícula y del área foliar, en este sentido los mejores porcentajes se obtuvieron en los tratamientos T3 y T5 pues se observaron valores de 96% en ambos tratamientos. Todo indica que los diferentes agentes desinfectantes empleados no afectaron marcadamente la germinación de las semillas. El menor porcentaje se observó en el T4 el cual mostró diferencias significativas con respecto al T3. En los resultados de la evaluación de los tratamientos de desinfección de las semillas de la variedad Gibara se observó una mejor respuesta de las semillas en el T3 al alcanzarse 90% de desinfección, considerándose éste el mejor tratamiento al diferenciarse significativamente de los tratamientos T1, T2 y T4. Es preciso destacar que en esta variedad fue mejor la respuesta de las semillas al tratamiento con hipoclorito de sodio y bicloruro de mercurio. La mayor afectación por bacterias se obtuvo en el T5 el cual se diferencia significativamente de los tratamientos T2 y T3 los que no fueron afectados por este tipo de microorganismo, esto corrobora lo planteado por González y Fernández (2007), quienes demostraron que la variedad Gibara es bastante susceptible a la contaminación por bacterias. En esta variedad se obtuvo el mayor porcentaje de contaminación por hongo (68%) en el T2 el cual difiere de manera significativa con el resto de los tratamientos lo cual mostró cierta susceptibilidad de esta variedad a estos microorganismos contaminantes. El valor más bajo fue 10%, se obtuvo con el empleo del T3 con el cual se logró

5 mitigar la acción de dichos microorganismos. Cervantes et al. (2002) lograron disminuir la afectación por hongos en semillas de maíz de la variedad Tusón empleando solamente hipoclorito de sodio 1%. En esta variedad se obtuvo la mejor respuesta a la germinación de las semillas aunque de manera general fue bastante similar a las de la variedad Tayuyo. Se observó el 98% de semillas germinadas en el T3 el cual se diferenció de los tratamientos T1, T2, y T4. CONCLUSIONES De los cinco tratamientos empleados para la desinfección de semillas de maíz, el tratamiento tres (T3) resultó ser el más efectivo en las variedades estudiadas al obtenerse el mayor porcentaje de desinfección y de semillas germinadas en ambas variedades. La variedad Gibara mostró los mayores índices de desinfección y alcanzó el mayor porcentaje de germinación de las semillas. BIBLIOGRAFÍA Alvarado, Y. Contaminación microbiana en el cultivo in vitro de plantas. En: Propagación y mejora genética por Biotecnología. Santa Clara: IBP, p Borras, L. [et al.] Seed dry weight response to source-sink manipulations in wheat, maize and soybean. A quantitative reappraisal. Field Crops Research, 86: , Cervantes, S. T. [et al.] Selección para rendimiento y heterosis de líneas endogámicas de maíz irradiado. Agrociencia 36(4): , Cornide, M. T. Genética vegetal. En: Cuba. Amanecer el Tercer Milenio. Ciencia, Tecnología y Sociedad. España: Editorial Debate, p Frame, R. [et al.] Improved Agrobacterium-mediated transformation of three maize inbred lines using MS salts. Plant Cell Reports, 25(10): , z González, A. y E. Fernández. Contribución de la mejora genética al incremento del rendimiento del maíz en Cataluña [en línea]. Disponible en: (Fecha de consulta: 10 abril, 2007). Murashige, T. y F. Skoog. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Plant 15: , Skirvin, R.M. [et al.] Storage water is a source of latent bacterial contamination in vitro. Trends Agric. Sci. 1:63-65, 1999.