EFECTOS in vitro DE LOS ACEITES ESENCIALES SOBRE EL DESARROLLO DE Fusarium verticillioides EN UN MODELO BIDIMENSIONAL SEMICUANTITATIVO.

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1 EFECTOS in vitro DE LOS ACEITES ESENCIALES SOBRE EL DESARROLLO DE Fusarium verticillioides EN UN MODELO BIDIMENSIONAL SEMICUANTITATIVO Introducción Los bioensayos son una de las alternativas utilizadas para la investigación de compuestos o extractos con actividad antimicrobiana. En dicha búsqueda, la efectividad de los fungicidas es determinada inicialmente en experimentos in vitro. Posteriormente se extrapolan los resultados obtenidos, al hospedador natural o al material que debe ser protegido. Con este objetivo, han sido desarrolladas varias pruebas para evaluar la utilidad práctica de estos compuestos, en el control de las plagas fúngicas (Zehr, 1978). Sin embargo los métodos usados para evaluar la actividad antifúngica y la elección de las pruebas varían de acuerdo al criterio de los investigadores (Cowan, 1999; López-García et al., 1992; Mangena & Muyima, 1999; Panizzi et al., 1993). El recuento de esporos germinados y la cuantificación del diámetro de la colonia, en hongos filamentosos, son algunos de los métodos más difundidos para evaluar la efectividad de diferentes compuestos sobre el desarrollo fúngico (Zehr, 1978). Es importante tener en cuenta que, aunque el procedimiento utilizado sea el mismo, los resultados obtenidos varían entre sí, ya que estos protocolos difieren en un número significativo de variables. A modo de ejemplo, algunos de los factores que podríamos nombrar son: el desarrollo de la cepa fúngica según el estado de agregación del medio, el nivel de exposición del microorganismo a la sustancia a evaluar, la solubilidad del extracto o de sus componentes, como así también la cantidad y el tipo de agente utilizado como emulsificante (Hili et al., 1997). Estos y otros factores podrían explicar la variabilidad de los resultados obtenidos, entre los diversos experimentos mencionados anteriormente. 36

2 Por consiguiente, las condiciones en el diseño del experimento, deben ser seleccionadas meticulosamente cuando se tiene como objetivo la evaluación de compuestos con actividad antifúngica. Además de lo expuesto anteriormente, otro inconveniente es que, en el caso de las levaduras, la valoración de la susceptibilidad antifúngica ha sido recientemente normalizada; no obstante, para los hongos filamentosos, está en proceso de desarrollo (Espinel-Ingroff et al., 1995; Espinel-Ingroff et al., 1997; NCCLS, 1997). Asimismo, la aplicación de antifúngicos en cereales y semillas almacenados, es relativamente reciente. Poco tiempo atrás, las infecciones fúngicas en los cereales, eran consideradas más un problema estético que una alteración real de la calidad sanitaria de dichos alimentos. Como consecuencia, se originaron nuevos interrogantes sobre los métodos de evaluación de antifúngicos, cuando los metabolitos tóxicos (micotoxinas) producidos por hongos filamentosos, fueron descubiertos en dichos sustratos. La aplicación de AEs de plantas aromáticas ha sido descripta como una alternativa antifúngica y antitoxigénica promisoria en algunas experiencias. Con el objetivo de emplear AEs en maíz para inhibir la producción de FB 1 por Fusarium verticillioides, se desarrollaron experimentos in vitro utilizando la evaluación de la susceptibilidad fúngica en agar semisólido (Provine & Hadley, 2000). La selección de este estudio se fundamenta en las condiciones de reducida presión de oxígeno del sistema, como una aproximación al proceso de infección fúngica que se genera en la semilla cuando el hongo invade el endosperma y las estructuras internas. Otro factor significativo es la interacción directa entre los AEs y el sustrato de desarrollo de la cepa fúngica. Por último el medio de cultivo proporciona soporte a los AEs, lo cual permite retardar la liberación de las fracciones volátiles de los AEs ensayados. En el presente capítulo se analiza la composición química de los AEs seleccionados y se evalúa su actividad inhibitoria sobre el desarrollo de F. verticillioides en un modelo bidimensional in vitro. 37

3 Los objetivos para el presente capítulo se enumeran a continuación: I- Caracterizar cuantitativa y cualitativamente la composición de AEs de plantas aromáticas seleccionados. II- Determinar la CIM de los AEs en un modelo bidimensional in vitro. III- Seleccionar los AEs de plantas aromáticas con mayor actividad fungistática sobre el desarrollo de F. verticillioides MRC Resultados I- Caracterización cuantitativa y cualitativa de la composición de AEs de plantas aromáticas seleccionados. La composición de los AEs analizados se observan en la tabla 3: El AE de Origanum vulgare (orégano, AEO) se caracterizó por su alto contenido en el terpeno alcohólico terpineol y el compuesto fenólico timol (la suma de ambos resultó el 42% del total de este aceite esencial). Otro componente, el γ-terpineno se encuentró en una proporción de 9,1%. Estos componentes totalizaron el 51,1% del AEO. En el caso de Aloysia triphylla, conocido como cedrón (AEC), de los 44 compuestos identificados en su AE, los que se encontraron en mayor proporción fueron cetonas, como la mircenona (36,5%), α-tujona (13,1%) y lippifoli 1 (6) ene 5 one (8,8%). Además se observaron otras especies químicas como: limoneno (6,8%), espatulenol (5,2%), germacreno-d (4,32%), alcanfor (4,1%) totalizando el 79% del aceite. El AE de A. polystachya (té de burro, AET) tuvo como constituyentes principales: carvona, α-tujona, y el limoneno que totalizaron el 82.8 % del aceite. Al igual que el AEC, el AET también contiene tujona, aunque en un porcentaje significativamente más elevado. El mentol fue el componente mayoritario (alrededor del 95% del total) del AE de Mentha piperita (AEM) (figura 6a). 38

4 Tabla 3: Componentes mayoritarios de AEs de plantas aromáticas Plantas aromáticas Componentes O. vulgare A. triphylla A. polystachya M. piperita Timol 21.2 Terpineol 21.1 γ-terpineno 9.1 Mircenona 36.5 α-tujona Limoneno Lipifoli 1 (6) ene 5 - ona 8.9 Espatulenol 5.2 Germacreno-D 4.3 Alcanfor 4.1 Carvona 38.2 Mentol 95.0 Otros Cantidades relativas de los componentes mayoritarios de los AEs analizados. Otros: componentes detectados en un porcentaje menor al 1% en los AEs a) Mentol Total Ion Current Scan Nº b) α-tujona Total Ion Current Limoneno Scan Nº Figura 6: Cromatogramas y espectros de masa del a) AEM en donde se observa el pico del componente mayoritario (mentol) y el patrón de fragmentación correspondiente, b) AET en el cual se observa el patrón de fragmentación de la α-tujona y el limoneno. 39

5 II- Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) de los AEs en un modelo bidimensional in vitro. Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) Entre los AEs examinados, Aloysia triphylla, Aloysia polystachya, Mentha piperita, Origanum vulgare, demostraron la mayor actividad inhibitoria sobre el desarrollo de F. verticillioides. El resto de los aceites seleccionados fueron descartados por su escasa acción antifúngica en este sistema. La evaluación en este modelo bidimensional se realizó de acuerdo al punto de materiales y métodos. Un ensayo preliminar permitió evaluar el efecto del DMSO y del etanol como vehículos. Los resultados no demostraron diferencias estadísticamente significativas entre ambos disolventes. Por lo tanto, para los experimentos posteriores se utilizó el etanol como vehículo. En la figura 7 se observa que el desarrollo de la cepa fúngica en el medio de cultivo sin agregados es similar al crecimiento del hongo en el medio adicionado con el vehículo. a b c Figura 7: Evaluación del etanol como vehículo para los AEs. a) Tubo control (+), con el medio de cultivo sin agregados, inoculado con F. verticillioides, luego de incubarse durante 96 horas a 27ºC. b) Tubo control (-), con el medio de cultivo sin agregados, sin inocular. c) Tratamiento con etanol, inoculado con F. verticillioides, luego de incubarse durante 96 horas a 27ºC Cuando todos los AEs fueron evaluados, no se observaron efectos sobre el desarrollo fúngico a bajas concentraciones (10 y 20 µl/l). Tampoco se encontró efecto inhibitorio con los AEC y AET a 40 µl/l ni AEM a 40, 50, 100, ý 200 µl/l (tabla 4). A diferencia de los tres anteriores, el AEO a 40, 50, 100, 200, µl/l redujo el desarrollo de la especie F. verticillioides en un 25 % (3 en la escala de evaluación del SAAS). Además una mayor reducción del hongo, en aproximadamente un 50%, se encontró cuando se colocó el AEO en una concentración mayor a 250 ppm (2 en SAAS). Mientras que a concentraciones de 500 y 1000 µl/l sólo se desarrolló un 25% (1 en la 40

6 escala SAAS) y a 1500 µl/l inhibió totalmente el crecimiento (0 en la escala SAAS) de F. verticillioides (figura 8 a, b, c, d). El AET mostró efecto similar a AEO sobre F. verticillioides; sin embargo, a 1500 µl/l, el AET no causó inhibición total del desarrollo fúngico. Los mismos efectos fueron obtenidos cuando fueron evaluados AEC y AEM administrados, en concentraciones de 1000 (figura 8e) y 1500 µl/l respectivamente. a b c d e Figura 8: SAAS del AEO a) Control (+) (4 en la escala de SAAS), b) AEO 1500 ppm (0 en la escala), c) Control (-) (idem b ) d) AEO 250 ppm (2 en la escala), e) AEO 1000 ppm (1 en la escala) Tabla 4: Concentración Inhibitoria Mínima de AEs sobre el desarrollo de F. verticillioides Aceites Esenciales Concentraciones a n = O. vulgare b c 4 c 4 A. triphylla b c 4 c 4 4 A. polystachya b M. piperita 0 1 b CIM de los AEs con mayor efecto inhibitorio sobre el desarrollo de F verticillioides. 0 Op. limpio, 1 - Desarrollo 25% o menos que Control, 2 - Aproximadamente 50% del Control, 3-75% del Control, 4 Comparable con el Control. a : µl de AE/l medio. b : CIM. c : Promedio de valores en que se inicia la acción fungistática en ppm 41

7 III- Selección de los AEs de plantas aromáticas con mayor actividad fungistática sobre el desarrollo de Fusarium verticillioides MRC 826. La selección de los AEs para los experimentos sobre maíz fermentado con F. verticillioides se realizó con el criterio de administrar la concentración mínima fungistática de acuerdo a los resultados observados en la CIM. Para ello se tomaron dos valores más próximos al valor 4 del SAAS, que es el puntaje asignado al desarrollo del control. En el caso del AEO las concentraciones que corresponden al valor 3 y 4 de la evaluación del SAAS fueron 40 ppm y 20 ppm. En relación a las dos concentraciones se calculó el promedio y fue utilizada en los experimentos sobre el maíz fermentado (30 ppm). El AEC mostró valores más altos para la mínima concentración que tuvo efecto sobre el desarrollo fúngico: 50 ppm y 40 ppm determinándose una cantidad final de 45 ppm de este AE para el ensayo sobre el maíz fermentado. 42

8 Conclusiones: I- Los AEs estudiados muestran una alta complejidad en su composición química, se caracterizan por presentar algunos componentes mayoritarios representativos del género y la especie y al menos otros 40 compuestos en una concentración menor al 1%. Sin embargo, el AEM se caracterizó por la presencia de un solo terpeno. II- Los AEs demostraron tener efectos tan variables sobre el desarrollo de Fusarium verticillioides MRC 826 como la diversidad presentada en su composición química. Todos los AES probados en esta etapa demostraron efectos inhibidores aunque en concentraciones diferentes. El AEO fue el inhibidor más activo del desarrollo fúngico, en relación a la concentración aplicada. Este comportamiento puede deberse a su significativo contenido en terpenos fenólicos. Probablemente, el efecto inhibidor que tuvo el AEC sobre el desarrollo de la cepa fúngica, fue debido al alto contenido en terpenos cetónicos que caracterizó a este AE. III- El AEO y el AEC fueron seleccionados para probar su actividad antitoxicogénica en base a su bioactividad a bajas concentraciones, cuando se los compara con los otros AEs utilizados en el modelo bidimensional. 43