CULTIVO DE CELULAS INSTALACIONES EQUIPAMIENTO

Transcripción

1 Cultivo celular : CULTIVO DE CELULAS Termino que se utiliza para denominar el crecimiento de células IN Vitro, incluyendo el cultivo de células aisladas. En los cultivos celulares las células no están organizadas en tejidos. Cultivo de tejidos : El mantenimiento o crecimiento de tejidos IN Vitro en modo tal que pueden llevar a cabo su diferenciación preservando su arquitectura y / o función Cultivo Primario : Es el cultivo iniciado a partir de células, tejidos u órganos tomados directamente de un organismo. Un cultivo primario debe ser considerado como tal hasta que se subcultivo por primera vez, en ese momento se transforma en una línea celular. Cultivo de Líneas : Una línea celular se inicia en el momento del primer subcultivo de un cultivo primario. Línea celular establecida: puede decirse que una línea celular se ha establecido cuando demuestra posibilidades de ser subcultivada indefinidamente. INSTALACIONES EQUIPAMIENTO Sala de lavado y esterilización Sala de producción de agua Sala de producción de medios y reactivos Droguero Áreas de cultivos primarios y líneas celulares Cámaras frío/calor Sala de microscopios Cabinas de seguridad biológicas Estufas de CO2 Freezer de -20ºC, -70ºC, -150ºC Termos de nitrógeno líquido 1

2 2

3 Cabinas Clase I Cabina Clase II 3

4 Cabina Clase III Medios de Cultivos Medio de cultivo químicamente definidos: Es una solución nutritiva para cultivo de células en la cual es conocida la estructura química de cada componente MEM-E MEM-D MEDIO 199 RPMI 1640 MEDIO HANK S 4

5 Minimum Essential Medium (MEM) Inorganic Salts PM mg/l mm Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhyd.) Potassium Chloride (KCl) Sodium Chloride (NaCl) Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4-H2O) Amino Acids PM mg/l mm Glycine L-Alanine L-Arginine hydrochloride L-Asparagine-H2O L-Aspartic acid L-Cystine 2HCl 313 L-Glutamic Acid 147 L-Glutamine 146 L-Histidine hydrochloride-h2o COMPONENTS Molecular Weight Concentration (mg/l) L-Isoleucine L-Leucine L-Lysine hydrochloride L-Methionine L-Phenylalanine L-Proline L-Serine L-Threonine L-Tryptophan L-Tyrosine disodium salt dihydrate L-Valine Molarity (mm)

6 Vitamins PM mg/l mm Choline chloride D-Calcium pantothenate Folic Acid i-inositol Niacinamide Pyridoxal hydrochloride Riboflavin Thiamine hydrochloride D-Glucose (Dextrose) Phenol Red SOLUCION TAMPON FOSFATO DULBECCO 10 X (SIN CALCIO, NI MAGNESIO) Para 1 litro: Disolver en 700 ml de agua tridestilada entibiada a 30ºC; agregando las drogas de una por vez, esperando completa disolución antes de agregar la siguiente: Na Cl 80 g KCl... 2 g Na2 H PO4..11,5 g KH 2 PO4 2 g H2O Tridestilada CSP 1 Litro Esterilizar por autoclavado (a 1 atmósfera durante 30 minutos) y dejar en descarga lenta. Se conserva en cámara a 4ºC, una vez frío. SOLUCIÓN DE AZUL TRYPAN (Trypan blue) PBS (1 X) 100 ml Azul Trypan 0,5 g Disolver perfectamente. Filtrar para separar el sedimento y fraccionar 6

7 TRIPSINA 0,30% (Para cultivo Primario) Tripsina 1:250.3 g Rojo Fenol 0,01 g PBS(1 X) CSP.1 Litro Disolver con agitación permanente y esterilizar por filtros 0,8 y 0,22 micrones. Se conserva en congeladora de (-20 ºC) TRIPSINA 0,25% (Para cultivo Primario de Fibroblasto Embrión de Pollo) Tripsina 1: g Rojo Fenol.0,01g PBS 1 X CSP 1 Litro Disolver con agitación permanente y esterilizar por filtros 0,8 y 0,22 micrones. Se conserva en congeladora de (-20 ºC) TRIPSINA 0,25% (1/5000 de Versene) Cl Na 8 g Cl K... 0,4 g D(+) Glucosa..1 g Na H CO3. 0,58 g EDTA 0,2 g Tripsina 1:250 2,5 g Rojo Fenol... 0,01g H2O bidest c.s.p.1 litro Disolver con agitación permanente y esterilizar por filtros 0,8 y 0,22 micrones. Se conserva en congeladora de (-20 ºC) ANTIBIOTICO 100 X Penicilina G Sódica U.I. Estreptomicina Sulfato 6,66 g Gentamicina.. 5 g PBS (1 X).1 litro Disolver con agitación permanente y esterilizar por filtros 0,8 y 0,22 micrones. Se conserva en congeladora de (-20 ºC) 7

8 Cultivo primario Es el cultivo iniciado a partir de células, tejidos u órganos tomados directamente de un organismo. Un cultivo primario debe ser considerado como tal hasta que se subcultivo con éxito por primera vez, en ese momento se transforma en una línea celular 8

9 9

10 10

11 Línea celular Se origina en el primer pasaje de un cultivo primario Cepa celular Línea celular continua 11

12 12

13 13

14 14

15 RECUENTO CELULAR El método para el recuento celular consiste en trabajar con una serie de factores conocidos, matemáticamente exactos (pipetas, títulos de dilución, capacidad de la cámara) con el objeto de determinar el número de estas. Se utiliza la cámara de Neubauer que posee en su zona central el retículo de Thoma y además, en sus cuatro ángulos, cuatro cuadrados grandes. Estos están subdivididos en 16 cuadrados menores. La cámara y el cubreobjetos deben estar limpios y desengrasados. Técnica: Se coloca el cubre sobre la cámara de modo que quede bien adherido en las bandas laterales de apoyo. Se mezcla la suspensión celular con un volumen igual de una solución de Azul Trypan al 0,5%. Se homogeiniza bien por pipeteo. Se recomienda utilizar tips. Se carga la cámara. Se mira con objetivo 10X para observar uniformidad. Se pasa a mayor aumento y se cuentan las células de los cuatro cuadrados grandes de las puntas. Se hace el promedio de la suma de los cuatro cuadrados, que nos da un N X. Se realiza el siguiente cálculo: X x 2 x : N de Células / ml. (El 2 es por la dilución al medio con el colorante vital, azul Trypan a la suspensión celular)(se multiplica por para llevar al ml. ya que el volumen de la cámara es de 0,1 mm3 o sea 1/ de ml) Para un recuento adecuado de células, deben estar dispersas, de modo que puedan contarse en forma individual. Sino deben realizarse diluciones: 1/10, 1/100, según corresponda. En estos casos la fórmula es: X x 2 x 100 x : N de Células / ml. NOTA: Las células muertas sufren una modificación de la permeabilidad y se colorean con el Azul Trypan. Utilizando este colorante podemos obtener el porcentaje de viabilidad. 15

16 16

17 17

18 Técnica de Congelamiento celular Revisar las células deben estar con una confluencia del 80 a 90%, monocapa en crecimiento (fase logarítmica) Descartar el medio de crecimiento. Lavar la monocapa con PBS (1X) sin Calcio ni Magnesio. Tripsinar la monocapa. Resuspender las células con medio de cultivo con 10% de Suero Fetal Bovino y contar. Centrifugar las células entre RPM durante 5 minutos. Resuspender con medio de congelamiento con una concentración aproximada entre 2 a 5 x 106 cél/ml. Llevar a volumen final para sembrar con medio de congelamiento. Llenar los criotubos. Conservar en congeladora a -70ºC. MEDIO de CONGELAMIENTO: Medio de Cultivo. 70% Suero Fetal Bovino 20% Dimetil Sulfóxido 10% 18

19 19

20 20

21 21

22 22

23 Efecto citopatico en células 23