Composición General del Medio de Cultivo.

Transcripción

1 Composición General del Medio de Cultivo. Sales: CaCl 2, NaHPO 3, MnSO 4, SnCl 2, etc). Aminoácidos: Ala, Val, leu, aasp, Gly Vitaminas (Biotina, ác. Fólico, pantotenato de sodio, riboflavina. Otros Componentes (glucosa, ác. Linoléico, rojo de fenol, timidina). 1. Suero o substitutos del suero. 2. L-Glutamina. 3. Antibióticos. 4. Factores de crecimiento adicionales. * hormonas, anticuerpos, el medio no debe estar suplementado.

2 Mezclas de Sales Basales. Solución Salina Equilibrada o Buffer (BSS) en el cultivo de células y tejido. En 1885, Sydney Ringer desarrolló una solución de sales inorgánicas para mantener la contractilidad del tejido cardiaco de mamífero. Una solución de sal menos específica fue diseñada por Tyrode para su uso en el trabajo con células primarias de mamífero. Solución de sal de Tyrode, fluido aceptado para la dilución de componentes proteicos. La función actual de la solución de sal equilibrada (buffer) en el cultivo celular es multifacética y puede dividirse en cuatro funciones principales. Fluido de irrigación, transporte y diluyente, mantiene el equilibrio osmótico intra y extracelulares. Proporciona a las células ciertos iones inorgánicos esenciales para el metabolismo normal célular. Combinado con hidrato de carbono (glucosa), fuente de energía principal para el metabolismo celular. Ofrece sistema de tamponamiento para mantener el medio en el intervalo de ph fisiológico (7.2 a 7.6). Contienen un requisito básico para cinco iones: Ca, Mg, K, Na, ion PO 4.

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4 Solución buffer: NaH 2 PO 4, Na 2 HPO 4, 0.1 mm Nombre Bicarbonato de sodio Cambio de ph durante filtración Glucosa El fosfato de Dulbecco tamponada con solución salina (D-PBS). No contiene Menos susceptible Con y sin 1.0 M, ph 7.4 (25 C) Sales equilibradas de Earle (EBSS) Sales equilibradas de Hanks (HBSS) 2,2 g / L 0,35 g / L Pueden requerir el ajuste después de la filtración. 1,0 mg / L

5 Medio de Cultivo Utilizados para el cultivo celular. Tienen una formulación específica. Medio de Eagle medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), Medio basal de Eagle (BME) DMEM original Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), 4X [aminoácidos y vitaminas] 1000 mg / L glucosa 4500 mg / L glucosa óptimo Ver dif. medios Ver medio Williams

6 Medios de Cultivo DMEM. DMEM/F12. Ham s F-10 y F-12. Medio 199. MEM. RPMI 1640.

7 Temperatura 37 o C Humedad Gas: CO 2 ph?

8 Estabilización del ph en el Medio de Cultivo. Si [CO 2 ], el ph. CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 HCO [ H + ] + CO = 3 ph Lo cual es neutralizado por una elevada [NaHCO 3 ]. específica p/c medio. El balance ácido-base es mantenido por NaHCO 3, buffer y componente nutricional.

9 ph opt. =7.4. Sistema buffer dentro del medio de cultivo. NaHCO 3 disociado y CO 2. Depende del CO 2 atm. NaHCO 3 + H 2 O Na + + HCO H 2 O. Na + + H 2 CO 3 + OH - Na + + H 2 O + CO 2 + OH -. Cuando la presión parcial del CO 2 es baja, el equilibrio, el medio [OH - ] y se torna básico. Incubadora entrada de CO 2. La capacidad buffer del sistema : H + + HCO 3 H 2 CO 2 CO 2 + H 2 O. una elevada concentración de OH- causa OH - + H 2 CO 2 HCO 3 + H 2 O.

10 pk. H 2 CO 3 HCO H , 6.35* HCO 3 CO H * *Valor termodinámico

11 Medio conteniendo Suero. Es el suplementó más frecuente. Razones: Algunas células sólo proliferan al adicionarle suero. Provee biodisponibilidad de hormonas. Incrementa la capacidad buffer del medio. El medio extracelular óptimo a las células. El suero es una mezcla compleja y heterógenea de proteínas, hormonas, factores de crecimiento, iones y otros componentes no definidos. Medio no definido, suero varía de lote a lote. Medios definidos, sin suero pero con apropiados suplementos. Diferentes animales. Rebaños. Razas. Países.

12 1. Suero de ternera. 2. Suero de ternera donante (ternera hasta de 8 meses). 3. Suero de ternera fetal (terneras fetales, por cardiopuntura). 4. Suero de caballo (edad desconocida). 6. Suero de cordero (< 6 meses). 5. Suero de mono (mono verde). 7. Suero de pollo (sacrificados). 8. Suero Humano (adultos). 9. Suero de porcino

13 El Suero Fetal de Bovino (SFB) es el suplemento de crecimiento más empleado para el medio de cultivo celular, Contiene un alto contenido de factores que promueven el crecimiento, ya sean definidos o no definidos, los cuales satisfacen los requerimientos metabólicos para el cultivo celular.

14 Producto. Sterile-filtered, suitable for cell culture. Origin Treatment Hemoglobin Endotoxin Fetal Bovine Serum. Australia origin, USDA approved. Australia Fetal Bovine Serum. Fetal Bovine Serum. USA origin, Charcoal Stripped. Fetal Bovine Serum USA origin, Dialyzed by ultrafiltration against 0.15 M NaCl, sterile-filtered. Fetal Bovine Serum USA origin, Heat Inactivated, sterilefiltered, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture Fetal Bovine Serum USA origin, γ-irradiated by SER- TAIN process. Fetal Bovine Serum. Fetal Bovine Serum. suitable for cell culture, suitable for hybridoma. Fetal Bovine Serum USDA approved countries. Fetal Bovine Serum USDA. SFB Fetal Bovine Serum non-usa origin, from USDA approved countries, Heat Inactivated. New Zealand USA USA USA USA USA USA non- USA non- USA Hemoglobin, 25 mg/dl Charcoal Hemoglobin, Stripped 20 mg/dl Dialyzed by ultrafiltration Hemoglobin, against 0.15 M 20 mg/dl NaCl Heat Inactivated Heat Inactivated Hemoglobin, 20 mg/dl Hemoglobin, 25 mg/dl Hemoglobin, 20 mg/dl Hemoglobin, 25 mg/dl Hemoglobin, 25 mg/dl Hemoglobin, 10 EU/mL 10 EU/mL endotoxin 10 EU/mL endotoxin 10 EU/mL endotoxin 10 EU/mL endotoxin 25 EU/mL endotoxin 10 EU/mL endotoxin 10 EU/mL endotoxin 10 EU/mL endotoxin 25 mg/dl endotoxin

15 Suero inactivado, incubado a 56º C, 30. Suero correcto? Tipo celular Experimento

16 Otros Suplementos Albúmina Proteínas de Transporte. Aminoácidos y Vitaminas. Factores de adhesión. Factores de Crecimiento y Citocinas. Hormonas. Antibióticos.

17 Preparación y Esterilización del medio de cultivo Ver medio Williams

18 Tanque de Gas Nitrógeno Tanque depósito del líquido a esterilizar Membranas para esterilizar Solución Estéril

19 Líneas celulares La Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC). Líneas celulares de una variedad de fuentes animales: Mamíferos, Anfibios Peces Insectos. Humanas. Ratón. Cáncer.

20 Medio de Cultivo libre de Suero, claramente definido. Al elegir (contenidos individuales del suero), frec. cant. fluctúan en cal, y Esto es importante cuando los experimentos son de tiempo prolongado. Sueros: Riesgo de contaminación microbial. Algunos medios con suero deben esterilizarse. Economía. El cambio a medio libre de suero, no debe ser abrupto. Medio Definido: se conoce la concentración de todos los componentes.

21 Cultivo Celular en el laboratorio. 1) Accesorios necesarios, instrumentos, etc. 2) Esterilidad en campana de flujo laminar. 3) Proveer a las células para un periodo de cultivo. 4) Preparado para experimentos en cultivo celular. Alrededores adecuados: Cuarto de cultivo. Campana de flujo laminar e incubadora. Preparación de medios de cultivo cuidadosa y críticamente. Considerar: oriesgo de movimiento. osin tráfico de personal. odistancias cortas entre unidades individuales. osuficiente espacio para moverse.

22 Seguridad en el Cultivo Celular. Reglas de seguridad y precaución (DNA, material patógeno, substancias radiactivas, carcinógenos, corrosivos, etc.) Prohibido: fumar, beber y comer. Ropa adecuada para protección, (bata algodón, gorros y guantes). Prohibido pipetear con la boca, utilizar pipeteadores o perillas estériles. Posibles peligros deben ser dados a conocer a los compañeros. Lavar manos entre descanso y descanso. Limpieza escrupulosa es proporcional a buenos resultados en el cultivo. Laboratorio limpio (piso, paredes, equipos, baños, gavetas, etc.). Cerrar llaves de gas al finaliza el trabajo. Limpiar regularmente: baños maría, incubadoras y campana de flujo. Entrada al cuarto de cultivo, sólo personal autorizado. Limitar el acceso de visitas.