Requerimientos de cultivos celulares Fase gaseosa y temperatura Medios de cultivo y suplementos

Transcripción

1 Requerimientos de cultivos celulares Fase gaseosa y temperatura Medios de cultivo y suplementos Dra. Isabel Nocito Área de Parasitología Departamento de Microbiología Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas

2 INTRODUCCIÓN HISTÓRICA Experimento de Ross Harrison (1907), donde el explanto es la porción de tejido neural de embrión de rata incluido en una gota de linfa. Describió el desarrollo de fibras nerviosas in vitro a partir de las neuronas presentes en el tejido extirpado y argumentó sólidamente la doctrina neural, resolviendo problemas básicos del cultivo celular, como el medio, la observación y la contaminación

3 1910 Burrows empleó plasma de pollo para nutrir explantes de tejido embrionario de pollo. Burrows y Carrel demostraron que la vida del cultivo se puede prolongar mediante subcultivo Rous y Jones emplearon extractos enriquecidos en tripsina para disociar células de embrión de pollo Rita Levi-Montalcini establecen que el factor de crecimiento nervioso estimula el crecimiento de los axones de tejidos en cultivo Eagle realiza la primera investigación sistemática de los requerimientos nutritivos de las células en cultivo. 1961, Hayflick y Moorhead establecieron que la duración de los cultivos de fibroblastos era finita y usaron por primera vez antibióticos. 1965, Ham introduce el primer medio definido libre de suero capaz de mantener algunas células de mamífero en cultivo indefinidamente Sato publica sus trabajos en los que demuestran que las diferentes líneas celulares requieren mezclas distintas de hormonas y factores de crecimiento para crecer en medios libres de suero.

4 CULTIVO CELULAR Naturaleza del sustrato Condiciones físico-químicas y fisiológicas del medio Naturaleza de la fase gaseosa Condiciones de incubación temperatura y humedad

5 SUSTRATO Cultivos Adhesión Suspensión Dependiente del anclaje Independiente del anclaje

6 MATERIALES VIDRIO PLÁSTICO Barato Lavable Fácil de esterilizar Poliestireno PVC (polivinilcloruro) Policarbonato PTFE (politetrafluoretileno) TPX (thermanox)

7 SUPERFICIES TRATADAS Matrices Cultivo de alimentación o monocapa (Feeder layers) Matrices tridimensionales Fibronectina Colágeno Gelatina Monocapa de células (fibroblastos de ratón 3T3 irradiados) Gel de colágeno Esponja de celulosa

8 SUSTRATOS ARTIFICIALES ALTERNATIVOS Sustrato no Adherente (agar-agarosa) Sustrato metálico (paladio-discos de acero) Microcarriers (poliestirenasephadex) Haces microcapilares

9 Haces microcapilares

10 Membranas plásticas porosas

11 ELECCIÓN DEL RECIPIENTE A USAR * Producción celular * Crecimiento celular en suspensión * Ventilación * Frecuencia del muestreo * Tipos de análisis * Costo

12 Catálogo Nunc

13 Roller bottles Incubador tipo roller

14 PROPIEDADES FÍSICO - QUÍMICAS DEL MEDIO ph Buffers Osmolaridad Temperatura Humedad Viscosidad Tensión superficial

15 ph * ph óptimo: 7,4 Variaciones ph: 7,4 7,7 (fibroblastos) ph: 5,5 (células epidérmicas) Indicador Rojo fenol Rojo ph: 7,4 Naranja ph: 7 Amarillo ph: 6,5 Amarillo limón ph < 6,5 Rosado ph: 7,6 Púrpura ph: 7,8

16 BUFFERS Bicarbonato/ ácido Carbónico Hepes (molécula orgánica sintética) Fosfatos Na y K / ácido Fosfórico Hepes ph: 7,2 7,6 Dosis: 5 a 20mM

17 Control de ph por el suministro de HEPES

18 Relación entre Hepes y bicarbonato

19 OSMOLARIDAD * Os: mosm/kg * La medida de la osmolaridad es un control de calidad del medio. * La osmolaridad puede afectarse por el agregado de Hepes o drogas disueltas en ácidos o bases.

20 TEMPERATURA * Temperatura óptima es 37º C. * Las células toleran temperaturas de 4ºC y 196ºC, pero no toleran temperaturas 39ºC. * La temperatura influye sobre el crecimiento de las células y el ph. * Si disminuye la temperatura se disuelve más el CO 2 y modifica el ph.

21 VISCOSIDAD * La viscosidad está influenciada por el contenido de suero y no tiene efecto sobre el crecimiento. * La agitación y la tripsinización dañan a las células. TENSION SUPERFICIAL * La tensión superficial debe mantenerse baja. Se altera por la aparición de espuma en los cultivos cuando se burbujea CO 2.

22 FASE GASEOSA: O 2 Y CO 2 Oxígeno Oxígeno: tensión baja de O 2 en la mayoría de los tejidos, pero en cultivos de órganos se necesita una tensión de O 2 del 95%. La presencia de Se está relaciona con la detoxicificación del O 2. La profundidad del cultivo debe ser de 2-5mm (0,2-0,5ml/cm 2 ).

23 CO 2 CO 3 H El CO 2 juega un rol importante en el medio influyendo en el CO 2 disuelto, regulando el ph y la cantidad de CO 3 H. H 2 O + CO 2 H 2 CO 2 H + + HCO 3 ph: pk a + log HCO 3 pka: 6,1 H 2 CO 2 Good' s buffers * HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethanesulfonic acid) * Tricina * Piruvato (medio de Leibovitz)

24 CONDICIONES FISIOLÓGICAS MEDIOS DE CULTIVOS CELULARES Medio basal de Eagle Medio esencial mínimo de Eagle Medio de cultivo Aislar y propagar células de un determinado linaje Requerir células como sustrato para obtener un determinado producto

25 Soluciones salinas balanceadas BSS Medios de cultivo Medios completos Con suero Sin suero

26 SOLUCIONES SALINAS BALANCEADAS (BSS) Compuestas por sales inorgánicas, bicarbonato, glucosa BSS: Hanks - Eagle Dulbeco PBS Poseen débil capacidad buffer

27 BSS

28 MEDIOS COMPLETOS Amplio rango de complejidad, simples como Eagle' s MEM a complejas como M 199, CMRL 1066 Composición: Aminoácidos, vitaminas, suplementos como nucleósidos, intermediarios del Ciclo tricarboxilo, factores de crecimientos, hormonas, lípidos, minerales

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30 AMINOACIDOS * AA esenciales y no esenciales. Tirosina, cisteína, glutamina, glutamatos VITAMINAS * Vitaminas lipo e hidrosoluble. La Biotina está incluida en casi todos los medios. SALES * Funciones: Ca ++ : adhesión, intermediarios de transducción, proliferación y diferenciación. Na +, K + Cl - : regulador de potencial de membrana. Sulfatos, carbonatos y fosfatos: precursores nutricionales de macromoléculas.

31 HIDRATOS DE CARBONO * Glucosa es la principal fuente de energía y es metabolizada por la glucólisis a piruvato * La fuente de C está dada por glutamina más que glucosa SUPLENENTOS ORGÁNICOS * Proteinas, péptidos, nucleósidos, piruvato, lípidos HORMONAS Y FACTORES DE CRECIMIENTO

32 ANTIBIOTICOS

33 ANTIBIÓTICOS DESVENTAJAS EN EL USO DE ATB * Desarrollo de organismos resistentes a ATB * Desarrollo a bajo nivel de contaminantes * Presencia de micoplasma * Presencia de efectos antimetabólicos * Técnicas de asepsia pobre

34 SUEROS Suero fetal bovino, suero bovino, suero de caballo, suero humano.

35 COMPOSICIÓN PROTEINAS * Albúmina, fibronectina, globulinas, macroglobulinas, transferrina FACTORES DE CRECIMIENTO * PDGF( fact. de crec. derivado de las plaquetas), FGF ( fact. de crec. del fibroblasto), EGF( fact. de crec. Epitelial) VEGF, IGF HORMONAS * Insulina, hidrocortisona, somatomedina OTROS NUTRIENTES Y METABOLITOS * Nucleósidos, glucosa, AA, lípidos (ac. linoleico, oleico), minerales (I, Cu, Zinc, Se) INHIBIDORES * Toxinas bacterianas, Ig, TGF- β

36 DESVENTAJAS DEL SUERO * Variabilidad fisiológica * Vida media * Calidad de control * Especificidad * Disponibilidad * Procesos posteriores * Contaminación * Costo * Inhibidores * Estandarización

37 Selección de medios de cultivos

38 APLICACIONES * BME (medio basal de Eagle): fibroblasto de ratón, HeLa * MEM: casi todo tipo de células * RPMI 1640: linfoblasto y líneas celulares leucémicas en suspensión * DMEM: selección de hibridomas * Medio L-15 de Leibovitz: cultivo de virus * Medio 199: células no diferenciadas y estudios de cromosomopatías * Medio F-10 de Ham: líneas celulares humanas. Es útil para el cultivo de células amnióticas. * Medio F-12 de Ham: líneas celulares con suplementos proteínicos

39 MEDIOS LIBRES DE SUEROS VENTAJAS * Medio selectivo * Regula proliferación y diferenciación DESVENTAJAS * Multiplicidad de los medios * Selectividad * Pureza de reactivos * Proliferación celular * Disponibilidad

40 El suero provee factores esenciales como factores de adhesión, nutrientes, péptidos y hormonas. Estos medios libre de suero requieren ciertos cambios en el procedimiento. Factores de adhesión Inhibición de proteasa Temperatura tripsina Hormonas Factores de crecimiento Nutrientes Minerales

41 RAZONES DE SU USO Promover crecimiento selectivo de la línea celular Evitar el uso de suero por riesgo de contaminación Presencia de proteínas del suero en los productos celulares Uso de líneas celulares de Banco de células que requieren medio sin suero

42 Medios libre de suero