Soluciones Cultivos Celulares Protocolos y técnicas Cultek

Transcripción

1 El medio de cultivo El cultivo celular se realiza en medios artificiales preparados mediante la mezcla de componentes purificados o de soluciones orgánicas complejas, en el interior de instrumentos que mantienen las condiciones físico-químicas adecuadas y sobre soportes o recipientes que los contienen y aíslan del medio exterior. Por ello consideraremos que el medio de cultivo estará formado por cuatro elementos: la naturaleza del sustrato o fase en que crecen las células, las condiciones físico-químicas y fisiológicas del medio, la naturaleza y composición de la fase gaseosa y las condiciones de incubación, especialmente la humedad y la temperatura. El sustrato de cultivo. La mayor parte de las líneas celulares crecen en forma de monocapa unidas a un soporte más o menos sólido. El crecimiento en suspensión está usualmente restringido a algunas líneas celulares especialmente de células hematopoyéticas y tumores ascíticos. Según si la línea celular precise o no unirse al sustrato para proliferar se dice que es dependiente (adhesión) o independiente (suspensión) de anclaje: La mayor parte de las células que se mantienen en cultivo proceden de disgregación tisular o de tumores formados por células adheridas y mantienen esa característica: necesitan adherirse al sustrato para mantenerse. Los cultivos en suspensión suelen coincidir con los de aquellas células que in vivo son circulantes, en general células sanguíneas. El gran interés que tiene el cultivo de células sanguíneas (linfocitos) ha extendido notablemente la caracterización de los cultivos en suspensión. El cultivo de células en suspensión tiene algunas ventajas: mayor facilidad de manipulación y pase de un cultivo al siguiente (replaqueo) pues no requieren separación del sustrato mediante por ej. tripsinización, posibilidad de cultivo en mayor escala pues sólo dependen de la accesibilidad del medio y de los gases pero no de la superficie del recipiente, etc... y algunas desventajas: son cultivos homogéneos en los que se pierden las interacciones (espaciales, de adhesión, etc...). Los tipos de sustrato más empleados en la actualidad son los siguientes: Vidrio. Empleado usualmente como sustrato de cultivo tiene como ventajas su escaso coste y su facilidad de limpieza y esterilización. Asimismo es especialmente útil para su posterior observación al microscopio por su calidad óptica. Plástico desechable. Muy empleado en la actualidad como material desechable estéril por irradiación. El plástico más empleado es el poliestireno, de buena calidad óptica. Debido a que este plástico es hidrofóbico requiere un tratamiento mediante irradiación-gamma, químico, o mediante descargas eléctricas que produzca una superficie hidrofílica. El tratamiento es característico de los diferentes suministradores, y por ello los productos varían en calidad de uno a otro. Aunque para la mayor parte de los usos rutinarios no es necesario, es recomendable probar muestras de distintos orígenes y medir la eficacia de plaqueo y las tasas de crecimiento para maximizarlas especialmente en aquellas líneas celulares de crecimiento difícil. Otros plásticos que se emplean son polivinil-cloruro, policarbonato (PVC), politetrafluoretileno (teflón, PTFE), thermanox (TPX). Actualmente es de gran interés, especialmente para el cultivo de células epiteliales polarizadas, el uso de membranas plásticas porosas. Un ejemplo de este tipo de cámara se representa en la figura. Microsoportes ("microcarriers"). Se trata de soportes plásticos (poliestireno), de sephadex o poliacrilamida en forma de pequeñas bolas ("beads") a las que se unen las células dependientes de anclaje. Estas bolas con las células adheridas se mantienen en suspensión. Otros sustratos artificiales. Se han desarrollado técnicas para crecer células de glia en sustratos metálicos, de paladio (Westermark, 1978) o en discos de acero (Birnie y Simmons, 1967). Superficies tratadas. La adherencia y crecimiento de las células en un frasco mejora en muchos casos si la superficie ha sido tratada con el medio de crecimiento de otro cultivo, debido a la presencia de colágeno o fibronectina liberada por las células, o bien sobre superficies recubiertas de proteínas de matriz extracelular (fibronectina, colágeno, vitronectina, Matrigel, etc...). Así, se pueden tratar los recipientes de cultivo con fibronectina (1 ng/ml) añadido al medio, o con colágeno. El tratamiento con colágeno desnaturalizado aumenta la adhesión de muchos tipos celulares, y especialmente de las células epiteliales Página 1 de 19

2 Muchos resultados parecen indicar que el tratamiento de las superficies con compuestos biológicamente activos pueden inducir alteraciones específicas de la adhesión o el comportamiento celular. Se han descrito métodos para la reconstitución de membranas basales con la finalidad de optimizar las condiciones de diferenciación celular (Reid y Rojkind, 1979). Estos resultados refuerzan la noción cada vez más extendida de que las interacciones célula-matriz extracelular son determinantes en la regulación de la proliferación y la diferenciación. Otros tratamientos que se han usado han sido: gelatina (músculo), poli-d-lisina (algunos teratomas de ratón). "Feeder layers". Se ha descrito previamente que algunos tipos celulares para crecer en cultivo y expresar sus características diferenciadas precisan de suplementos específicos. Una manera de obtener estos suplementos es la de hacerlos crecer sobre los restos de monocapas de otros tipos celulares. Estas monocapas previas se esterilizan o se inhibe su crecimiento (normalmente por irradiación X o gamma). Este efecto podría ser debido a dos posibilidades: suplementación del medio, o modificación del sustrato. Una de las monocapas más empleadas son los fibroblastos de ratón 3T3 irradiados. Matrices tridimensionales. Son sustratos en los que las células penetran, estableciendo una distribución tridimensional: geles de colágeno (Douglas y col., 1980), esponja de celulosa sola (Leighton y col., 1951), o recubierta de colágeno (Leighton y col., 1968), o "gelfoam". En estas matrices muchos tipos celulares crecen y se establecen de una manera análoga a como lo hacen en el tejido de origen: células epiteliales de mama se organizan en disposición tubular, mientras que las células del carcinoma de mama lo hacen de una forma mucho más desordenada (Yang y col., 1981). Sustratos no adherentes. Son sustratos que no permiten la adhesión celular, por ejemplo agar, agarosa, o methocel (metilcelulosa de alta viscosidad). Son de utilidad en situaciones en las que no conviene que exista dispersión de las células derivadas de una originaria, por ejemplo en los procesos de aislamiento de colonias infectadas por virus. Interfases líquido-gel o líquido-líquido. Se han observado en algunas situaciones proliferación celular y adhesión a las interfases líquidolíquido o líquido-gel, a pesar de que se desconocen exactamente los mecanismos (Rosenberg, 1965). Haces microcapilares permeables ( hollow fiber ). Son cámaras de crecimiento de células formadas por un recipiente cilíndrico en el que se siembra, y en el interior del cual hay un haz de capilares plásticos permeables adecuados para que las células se adhieran. Los capilares se encuentran conectados a un circuito de recambio del medio. Este dispositivo ofrece una gran superficie de crecimiento apta para el crecimiento celular, y un eficaz sistema de recambio del medio. Tal como se ha descrito previamente, el material más utilizado como sustrato es el plástico desechable, en forma de diferentes tipos de recipientes. Los más comunes son: placas de Petri (ventiladas). Disponibles en 3 tamaños: 3,5, 6,0 y 10 cm de diámetro son las más empleadas cuando se trata de crecer las células para usar directamente en experimentos. No es recomendable, por su escasa estanqueidad, emplearlas para el mantenimiento de líneas Página 2 de 19

3 multiplacas. Es una variante de las placas de Petri. Placas de varios pocillos, desde 6 a 96 pocillos. frascos de Roux (botellas ventiladas o no). Disponibles en diferentes tamaños, son recomendables para el mantenimiento de las líneas y la producción de células, o bien para el crecimiento de células en suspensión. "roller bottles". Se trata de tubos, con una cara plana sobre la que se fija el cultivo, y que se incuban en los incubadores dotados de "roller". Existen variantes con una gran superficie de adhesión (espirales de plástico...) y que se destinan a la producción de gran número de células. Incubador tipo roller Roller bottles La fase gaseosa. Los componentes más significativos de la fase gaseosa son el oxígeno y el dióxido de carbono: Oxígeno. Las necesidades de oxígeno para la mayor parte de los cultivos celulares es cubierta con la tensión atmosférica, aunque existen cultivos, especialmente los cultivos de órganos que requieren una tensión de oxígeno superior (del 95%) posiblemente debido a la geometría del órgano y a las dificultades de difusión del gas en su interior. Se ha propuesto (McKeehan y col., 1976) que los requerimientos de selenio en el medio podrían ser debidos a su papel en la detoxificación de radicales de oxígeno, especialmente en los medios sin proteínas séricas. Dióxido de carbono. El dióxido de carbono juega un complejo papel en el medio debido a que influye la cantidad de CO 2 disuelto, el ph y la cantidad de iones HCO 3 -. Las reacciones que tienen lugar en el medio son: + H + 2O CO2 H2CO3 H + HCO3 [1] Página 3 de 19

4 + NaHCO 3 Na + HCO 3 [2] El incremento de la concentración de ión bicarbonato desplaza la ecuación [1] hacia la izquierda, de modo que el ph se establezca en 7,4. Se puede emplear asimismo otra base, por ejemplo NaOH, siendo la ecuación: NaOH H2 CO3 NaHCO3 H2O Na + HCO3 + H2O [3] De modo que para establecer un ph determinado se debe tener en cuenta especialmente los niveles de bicarbonato sódico y la tensión de CO 2. Cada medio tiene una concentración recomendada de bicarbonato y tensión de CO 2 para alcanzar el ph correcto. Sin embargo, se emplean otras sustancias tamponadoras en la formulación de muchos medios en la actualidad, lo que permite una estabilidad superior del ph en el medio, así como una mayor capacidad tamponadora (los denominados Good's buffers: HEPES, Tricina,.. (Good et al., 1966)). Aunque aparentemente podría ser posible prescindir del bicarbonato en la formulación del medio, esto se ha revelado falso, debido probablemente a que la ausencia de bicarbonato sódico desplazaría la ecuación [1] hacia la derecha, de modo que tendería a desaparecer el CO 2 disuelto y eventualmente el ión bicarbonato, ambos aparentemente necesarios para el crecimiento celular (Itagaki y Kimura, 1974). Una alternativa es la suplementación del medio con piruvato. Esto permite a muchos tipos celulares incrementar su producción de CO2 endógeno, haciéndolas independientes de la aportación de CO2 exógeno. En resumen, los cultivos crecidos a baja densidad en un recipiente abierto precisan una atmósfera de CO 2, cuya concentración esté en equilibrio con el bicarbonato sódico en el medio. A concentraciones celulares muy reducidas (por ej. durante el clonaje) es necesario añadir CO 2 en la fase gaseosa de los frascos cerrados. Cuando la concentración celular es más elevada puede no ser necesario añadir CO 2 a frascos cerrados, pero si en frascos abiertos. En los casos en los que la densidad celular sea elevada, con mucha producción de ácido es recomendable, por la elevada producción de CO 2 endógeno, mantener abierto el recipiente de modo que se pueda eliminar el exceso. En estos casos es especialmente recomendable suplementar el medio con HEPES para asegurar un correcto control del ph del medio. Propiedades físicas. Las características del medio son: ph, osmolaridad, temperatura, viscosidad y tensión superficial. ph y capacidad tamponadora. El ph óptimo de crecimiento para la mayoría de tipos celulares es de 7,4 aunque existen pequeñas variaciones: algunas líneas normales de fibroblasto crecen mejor entre ph 7,4 y 7,7 y células transformadas lo hacen en el margen de ph de 7,0 a 7,4 (Eagle, 1973), células epidérmicas pueden ser mantenidas a ph 5,5 (Eisinger y col., 1979). El indicador de ph que se suele emplear es rojo fenol, que presenta color rojo a ph 7,4, naranja a ph 7,0, amarillo a ph 6,5, azul-rojo a ph 7,6 y púrpura a ph 7,8. El medio de cultivo debe estar tamponado, a fin de evitar los cambios bruscos de ph. La solución tamponadora más empleada sigue siendo el tampón bicarbonato, que equilibra el CO 2 atmosférico, a pesar de su escasa capacidad tamponadora, debido a: su bajo coste, baja toxicidad, y beneficios nutricionales para el cultivo. HEPES es la solución tamponadora de elección por su elevada capacidad tamponadora en el rango 7,2 a 7,6, y se emplea en concentraciones de 10 a 20 mm. Cuando se usa conjuntamente con CO 2 externo, debe estar a concentración doble del bicarbonato para un tamponamiento adecuado (ver figura 3.3). Osmolaridad. Muchas células en cultivo tienen una amplia tolerancia frente a la osmolaridad del medio, creciendo bien en el rango de 260 a 320 mosm/kg, con pequeñas variaciones dependiendo de la especie considerada. Es recomendable emplear medios ligeramente hipotónicos para compensar la evaporación durante el periodo de incubación, especialmente en incubadores sin control de la humedad ambiente. La osmolaridad se controla mediante la determinación del punto de congelación o la elevación de la presión de vapor. Hay que tener en cuenta que la adición de HEPES, de drogas disueltas en ácidos fuertes y la neutralización posterior pueden afectar fuertemente a la osmolaridad del medio. Temperatura. La temperatura tiene gran influencia en la tasa de crecimiento de las células, de ahí la importancia de un buen control de ésta en la incubación. Influye asimismo en el ph del medio, por lo que se recomienda o bien ajustar el ph del medio 0,2 unidades por debajo del óptimo, a temperatura ambiente, o bien preparar el medio completo, incluso suero, dejar equilibrar en la estufa y después ajustar el ph, antes de añadirlo al cultivo. Viscosidad. La viscosidad del medio viene determinada fundamentalmente por el contenido en suero y tiene poca influencia sobre el crecimiento. Sí es importante para evitar el daño celular en la agitación del cultivo (menor daño a más viscosidad) y en la tripsinización. Se puede incrementar la viscosidad, especialmente en medios libres de suero, añadiendo al medio carboximetil-celulosa o polivinilpirrolidona (Birch y Pitch, 1971). Tensión superficial. La tensión superficial se ha de mantener baja, y en general sólo se ve alterada por la aparición de espumas en los cultivos en suspensión donde se burbujea CO 2. En estos casos es recomendable emplear un agente antiespumante de silicona pues en éstos casos se produce un aumento de la desnaturalización de proteínas y se incrementa el riesgo de contaminación si la espuma alcanza el cuello del recipiente de cultivo. Condiciones fisiológicas. Hacen referencia a la composición del medio. Ya se indicó que la principal dificultad para el establecimiento de las líneas celulares es el de obtener medios nutritivos adecuados que sean capaces de reemplazar al medio "natural" como extractos embrionarios, hidrolizados de proteína o sueros. Un primer grupo de medios tales como el medio basal de Eagle (MEM) (Eagle, 1955, 1959) y el más complejo 199 de Morgan y col. (Morgan y col., 1950) o CMRL 1066 de Parker y col. (1950) eran medios definidos pero que precisaban de un suplemento de suero entre el 5 y el 20%. A fin de eliminar el aporte de medios complejos no definidos se han ido formulando medios más complejos como NCTC 109 (Evans y col, 1956), 135 (Evans y Bryant, 1965), MB572/1 (Waymouth, 1959), Ham F10 y F12 (Ham, 1963, 1965), serie de los MCDB (Ham y McKeehan, 1978) y los medios de Sato suplementados con hormonas (Barnes y Sato, 1980). La aproximación recomendada para establecer un medio definido es empezar con un medio rico, por ejemplo Ham F12, suplementado con elevada concentración de suero (20%) y probar suplementos que permitan reducir la cantidad de suero hasta poderla reducir o suprimir. Después de años de investigación en la composición de los medios la elección de éstos sigue siendo empírica. Los principales medios empleados y sus aplicaciones son: Medio Basal de Eagle (BME). Medio elemental con sólo los aminoácidos esenciales. Se necesita siempre la suplementación con suero bovino fetal al 10 %. Crecimiento de fibroblastos de ratón y células HeLa Página 4 de 19

5 Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM). Es el medio de uso más corriente, contiene más aminoácidos y en mayor concentración que el BME. Se usa para cada casi todo tipo de cultivos y requiere la adición de suero (10%). RPMI Medio diseñado para el crecimiento de linfoblastos y líneas celulares leucémicas en suspensión. Tiene un amplio rango de aplicaciones con suplementos adecuados. Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM). Contiene cuatro veces la concentración de aminoácidos y vitaminas que el BME. Se usa para la selección de hibridomas suplementado con HAT o HT. Modificación de Iscove del medio DMEM (IMDM). Es un medio muy completo que incluye en su formulación albúmina bovina, transferrina, selenito, et... Es muy útil para el cultivo de linfocitos en medio libre de suero. También sirve para otros tipos celulares, pero en ese caso requiere suero a bajas concentraciones. McCoy 5A. Medio diseñado para el crecimiento para el crecimiento de líneas celulares diploides tanto de rata como humanas. Medio L-15 de Leibovitz. Utilizado para el cultivo de virus. Medio F-10 de Ham. Para el crecimiento de líneas celulares humanas, debe ser suplementado con proteínas y hormonas. Contiene metales como Fe, Cu, Zn. Es útil para el cultivo de células amnióticas. Medio F-12 de Ham. Útil para el crecimiento de líneas celulares son suplementos proteínicos. Combinado con IMDM es un medio que se usa como libre de suero. Medio 199. Muy usado para el cultivo de células no diferenciadas y estudio de cromosomopatías. Todo medio de cultivo está formado por los siguientes elementos: Soluciones salinas equilibradas (BSS). Una solución salina equilibrada es una mezcla de sales inorgánicas, incluyendo usualmente bicarbonato sódico, y suplementada con glucosa. Se usan para diluir medios más completos, como medio de disección o lavado, o para incubaciones cortas que requieren un medio isotónico no completo nutricionalmente. Su elección dependerá de: la tensión de CO 2. La concentración de bicarbonato deberá permitir el equilibrio a ph 7,54 a 36,5ºC. Así BSS-Eagle es más usada para 5% CO 2 y BSS-Hank (HBSS) es usado a la tensión atmosférica normal. su uso en la disgregación de tejidos o monocapas. En ese caso deberán carecer de Ca 2 + y Mg 2 +. Son recomendables los medios de Moscona, CMF, o PBS de Dulbeco o Vogt (PBSA). su uso para el cultivo en suspensión o de células en monocapa. Es recomendable el uso de MEM(S), variante de MEM sin Ca 2 + que reduce la agregación celular y la adherencia. Debido a su escasa capacidad tamponadora se recomienda suplementarlo con HEPES para ph en el rango 7,2 a 7,8 y Tricina en el rango 7,4 a 8,0. Aminoácidos. Es necesario suplementar el medio basal con los aminoácidos esenciales. Asimismo se suplementa con otros aminoácidos, pues los requerimientos pueden variar de una célula a otra. Un suplemento común es el de glutamina, a 2 mm final, aunque hay algunas líneas celulares pueden usar el glutamato. La glutamina es inestable en el medio, y se recomienda añadirla a partir de un stock concentrado (100 ) que se mantiene congelado, no más de 1 semana antes de añadir el medio al cultivo (conservando a 4ºC). Vitaminas. El medio MEM sólo suplementa con vitaminas del grupo B, siendo los demás grupos aportado por el suplemento de suero. En medios más definidos se suplementan todas las vitaminas. La limitación de vitaminas se manifiesta en la supervivencia de las células y en la reducción de la tasa de crecimiento más que en la densidad celular. Glucosa. Es la fuente de energía en muchos medios. Metabolizada preferentemente vía glucólisis hacia piruvato que puede ser convertido en lactato o acetoacetato que entra el ciclo de Krebs, y genera CO 2. La acumulación de ácido láctico en el medio propio de células embrionarias y transformadas parece indicar un funcionamiento diferente del ciclo de Krebs en estas células respecto al modelo in vivo. En estos casos la mayor parte del CO 2 parece proceder de un uso de la glutamina/glutamato. Otros suplementos orgánicos de bajo peso molecular. Dependiendo del medio, éste incluye en su formulación nucleósidos, intermediarios del ciclo de Krebs, piruvato, lípidos,... La adición de piruvato en el medio permite al cultivo incrementar su producción endógena de CO 2 haciéndole independiente de la aportación exógena de éste. El medio de Leibovitz L15 contiene una concentración superior de piruvato y no contiene bicarbonato sódico, y no requiere aporte de CO 2 en la fase gas. Hormonas y factores de crecimiento (suero). En los medios no definidos suele aportarlos el suero. Los tipos de suero empleados son suero de ternera ("calf serum", CF), suero bovino fetal ("fetal calf serum", FCS), suero de caballo ("horse serum", HS) y suero humano ("human serum", HuS). El más usado es el suero de ternera, mientras que el suero bovino fetal es usado en líneas más exigentes, y el suero humano en líneas humanas. La utilización de suero es problemática pues: a pesar de que la composición del suero es conocida, existen gran cantidad de componentes presentes en cantidades variables en éste que pueden influir notablemente en el cultivo (hormonas, factores de crecimiento...) el suero varía de lote a lote, y cada uno se puede emplear como máximo 1 año, probablemente deteriorándose a lo largo de ese tiempo, a pesar del almacenamiento a baja temperatura. cada cambio de lote de suero requiere realizar una serie de controles tediosos y costosos. si se cultivan varios tipos celulares cada uno puede requerir un lote diferente, lo que complica el almacenamiento e incrementa los costes. crea una dependencia importante de un suministro que no siempre puede mantenerse con la periodicidad y calidad requerida. si se han de purificar productos del medio de cultivo la presencia de los componentes del suero dificulta notablemente estos procesos. el suero está contaminado con desgraciadamente demasiada frecuencia por virus y micoplasmas, lo que representa un grave peligro para el cultivo. algunos factores séricos como el factor de crecimiento plaquetario (PDGF) estimula la proliferación de fibroblastos, lo que puede ser un problema en el establecimiento de cultivos primarios especializados Página 5 de 19

6 En conjunto supone un gran inconveniente para la estandarización de protocolos experimentales y de producción. Por ello se realizan importantes esfuerzos para la definición de medios definidos para el crecimiento celular. Esto, además de la reproducibilidad buscada, permite establecer medios selectivos en los que crezca el tipo celular deseado. Tienen como desventaja la gran cantidad de esfuerzo necesario para su definición, así como que en muchos casos el crecimiento de las células en estos medios es menor, las líneas finitas permanecen viables menos generaciones, así como el hecho probable de que la adaptación del cultivo al medio libre de suero supone un tipo de selección per se. Para conseguir reemplazar el suero completamente de un medio será necesario reemplazar: los factores de adhesión como la fibronectina. Células crecidas en medios libres de suero requieren el suplemento de fibronectina (25-50 μg/ml) o laminina (1-5 μg/ml) en el medio, o bien el tratamiento de las placas con poli-lisina (1 mg/ml) antes de la siembra. inhibidores de proteasas. Después de la tripsinización de un cultivo el exceso de actividad tríptica se inhibe por la adición de suero al medio. En ausencia de éste deben usarse inhibidores de proteasas como el inhibidor de tripsina de soja. hormonas. El complemento hormonal dependerá especialmente del tipo celular, tales como hormona de crecimiento, T3, hidrocortisona, dexametasona, FSH,... factores de crecimiento peptídico. En la actualidad se han identificado algunos polipéptidos de actividad mitogénica: FGF ("Fibroblast Growth Factor"), EGF ("Epidermal Growth Factor"), PDGF ("Platelet Derived Growth Factor") y MSA, y con un rango amplio de actividad. Asimismo se han aislado otros factores con mayor especificidad de acción. nutrientes: Fe, Cu, Se, y otros minerales, a pesar de que los fundamentos de su función son desconocidos en muchos casos. proteínas y poliaminas. La inclusión de albúmina bovina añade indefinición al medio, por ello se recomienda el uso de BSA libre de ácidos grasos (usualmente a 1-10 mg/ml). Transferrina (10 ng/ml) se requiere como portador de Fe, y se cree que puede tener actividad mitogénica. Putrescina se usa a alrededor de 100 nm. A fin de reemplazar el suero se han desarrollado una serie de sustitutos comerciales como son SerXtend (NEN), Ventrex (Ventrex Lab Ltd.), Nu-serum (Collaborative Res.),... Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibióticos y antifúngicos). A fin de evitar el crecimiento de contaminantes en el cultivo se suele suplementar éste con sustancias antibióticas de diferente espectro de acción. La adición de antibióticos ha de ser estrictamente controlada para evitar efectos nocivos sobre el cultivo. Es importante tener especial cuidado cuando se combinan dos o más antibióticos. Las mezclas de uso más común son: Penicilina (100 U/mL) / Estreptomicina (100 μg/ml). Combinación anti-microbiana. Penicilina (100 U/mL) / Estreptomicina (100 μg/ml) / Fungizona. Combinación anti-microbiana y anti-fúngica. Gentamicina (50 μg/ml). Anti-microbiana, conviene ir alternándola con la penicilina-estreptomicina. Anfotericina-B (2,5 μg/ml). Antifúngico y antilevaduras. Se han observado algunos efectos secundarios sobre el crecimiento de células de médula ósea humana en cultivo Página 6 de 19

7 Las contaminaciones. Uno de los problemas más frecuentes en el cultivo de tejidos en general es el de las contaminaciones. Las células eucariotas en cultivo crecen lentamente, con tiempos de duplicación superiores en muchos casos a las 24 h. Sin embargo, tanto las bacterias como las levaduras tienen una tasa de crecimiento superior. Si se da el caso de una contaminación por estos organismos pueden provocar la muerte del cultivo en poco tiempo. Para evitarlo se utilizan una serie de técnicas de trabajo que suponen la máxima asepsia, así como la esterilización del material y el trabajo en ambientes estériles (cabina de flujo laminar). Asimismo se utilizan cócteles de sustancias antimicrobianas y antifúngicas en el medio aunque en multitud de ocasiones no es posible usarlas o bien no son suficientes para prevenir la aparición de microorganismos. Los tipos de contaminaciones más frecuentes son por bacterias, por hongos y levaduras, por micoplasmas y por virus: Contaminación bacteriana y por levaduras. Los medios de cultivo proporcionan un medio ideal para el crecimiento de los contaminantes microbianos, y los procedimientos habituales de manipulación (abertura de recipientes, pipeteado,...) son susceptibles de provocar contaminación por bacterias. Los antibióticos, añadidos en los cultivos a corto plazo de forma habitual no son recomendables en los cultivos a largo plazo. Para evitar las contaminaciones por bacterias es necesario extremar las condiciones de esterilidad y realizar una serie de controles sobre las soluciones y recipientes a usar. Así es recomendable comprobar el estado de contaminación de cualquier tipo celular antes de introducirlo en las salas donde se trabaja con otros tipos celulares... Los controles de esterilidad están diseñados para detectar no aquellos contaminantes de crecimiento rápido y que producen cambios notables en el medio de cultivo pues estos se detectan fácilmente incubando alícuotas de medio en la estufa durante 24 o 48 h, sino aquellos otros de crecimiento lento y que no se producen cambios apreciables en el cultivo. No existe un test único capaz de detectar todos los contaminantes. La fuente más frecuente de contaminación es la atmósfera. Las precauciones a tomar serán: trabajo en ambiente estéril, en una cabina de flujo laminar o en el área de influencia de un mechero bunsen. usar pipeteadores automáticos y pipetas automáticas. Si no se dispone de estos nunca pipetear directamente con la boca sino mediante un tubo de goma y intercalando algodón en la boca de la pipeta. mantener los recipientes abiertos tan poco tiempo como sea posible. todas las botellas de medio y de soluciones atemperadas en un baño deben secarse cuidadosamente antes de usarlas. ante cualquier duda limpiar con alcohol 70% o flamear el material que pueda estar contaminado si no es reemplazable, o reemplazarlo si es posible. si se descubre un recipiente contaminado no se debe abrir. Si se han de tomar muestras para su análisis conviene hacerlo en ambiente estéril y después limpiar cuidadosamente el área de trabajo y conectar la iluminación UV. De todas formas no es fácil reducir a una lista las precauciones a tomar y la única forma de aprender es practicar bajo supervisión. Contaminación por micoplasmas. Los micoplasmas son células procariotas pequeñas (0,3 a 0,5 μm de diámetro) que pueden formar pequeñas colonias similares a las que forma el agente productor de la pleuroneumonía bovina (de ahí su nombre de "pleuropneumonia-like organisms", PPLO). No poseen pared celular y por ello sólo son capaces de crecer en ciertos medios. Existen varios grupos serológicos de micoplasmas de dos géneros (Mycoplasma y Acholeplasma). Los contaminantes responsables de las infecciones de los cultivos celulares proceden mayoritariamente de 4 especies: M.orale (humano), M.hyorhinis (cerdo), M.arginini (bovino) y A.laidlawii (bovino y también de roedores). Los cultivos primarios suelen estar libres de micoplasmas, pero muchas de las líneas celulares continuas están infectadas. La contaminación suele proceder de suero animal contaminado con A.laidlawii y M.arginini o de la tripsina de cerdo contaminada con M.hyorhinis. A pesar de que M.hominis, M.pharyngis y M.salivarum se pueden aislar de la boca y la garganta humana, la mayor fuente de contaminación procede del uso de cultivos contaminados. Se citan datos de que alrededor del 50 al 95% de las células utilizadas actualmente están contaminadas con micoplasmas. Dado que la contaminación con micoplasmas no es tan evidente como la contaminación por bacterias o levaduras es importante por una parte tener en cuenta el posible efecto de los micoplasmas sobre el cultivo, y realizar controles periódicos de su presencia. Los efectos dependen de la especie implicada. Así las especies M.gallisepticum y M.mycoides son patógenos pero son poco frecuentes. Otras especies no producen la muerte celular pero retardan el crecimiento celular. Así por ejemplo M.hominis parece retardar el crecimiento del cultivo pues consume toda la arginina presente debido a su elevada actividad arginina deaminasa, mientras que A.laidlawii destruye rápidamente los desoxirribonucleótidos, y en un cultivo infectado es realmente difícil realizar medidas de incorporación de timidina tritiada pues ésta es rápidamente convertida a timina. Los requerimientos de los micoplasmas son complejos y sólo crecen en medios donde hay células en crecimiento. Parece que requieren los productos de degradación de ADN celular, pues los nucleósidos son factores de crecimiento esencial para los micoplasmas. Una observación cuidadosa de las células en cultivo puede dar un primer aviso de la presencia de micoplasmas: aparición de gránulos oscuros en el citoplasma. A continuación se detallan algunas de las técnicas usadas en la actualidad para la detección de los micoplasmas: Tinción con orceína (Fogh y Fogh, 1968). sembrar las células sobre cubreobjetos de modo que no hayan alcanzado la confluencia en 24 h. sumergir el cubreobjetos en una placa de Petri con 3 ml de citrato sódico 0,6% y añadir lentamente 1 ml de agua. Dejar 10 min y añadir lentamente 4 ml de fijador de Carnoy (1:3 acético:etanol). Sacar todo el líquido y reemplazar por 2 ml de fijador de Carnoy. dejar fijar durante 10 min. Dejar secar. teñir 10 min con orceína, y lavar 3 veces con etanol absoluto. montar en DPX, observar con el microscopio de contraste de fase. Las células contaminadas muestran los micoplasmas preferentemente en el borde celular y en los espacios intracelulares. Autoradiografía de cultivos incubados con timidina tritiada. Un cultivo contaminado muestra señal autoradiográfica fuera del núcleo por efecto de la degradación de la timidina a timina propia de muchos micoplasmas Página 7 de 19

8 Tinción fluorescente con Hoechst 33258, o DAPI. Esta técnica detecta el DNA de los micoplasmas pues el colorante (Hoechst o 33532, o el DAPI) se une específicamente al DNA. Se emplea la misma técnica de tinción que para la tinción nuclear. Cultivo negativo a micoplasmas (ATCC) Cultivo positivo a micoplasmas (ATCC) Test de crecimiento para micoplasmas. El efecto letal de la contaminación por micoplasmas sobre el cultivo puede acentuarse mediante la adición al medio de 6-metilpurina desoxirribonucleósido (6-MPDR). Todos los micoplasmas presentan gran actividad del enzima adenosina fosforilasa, capaz de convertir 6-MPDR (no tóxico) en 6-metil purina y 6 metil-purina ribonucleósido, ambos tóxicos para las células de mamífero (McGarrity y Carson, 1982). Existen sistemas de cultivo de micoplasmas de gran sensibilidad que permiten detectar la presencia de pequeñas cantidades de contaminante. Es el caso del Método directo de cultivo que propone ATCC en su servicio de detección de micoplasmas. Este cultivo sin embargo tiene como gran limitación los 28 días que precisa. Sonda DNA para micoplasma. Es una sonda de DNA tritiada capaz de reconocer el RNA ribosomal de micoplasma en cultivos celulares. Es muy sensible, pero aún cuesta 10 veces más que el ensayo de Hoechst. Supone obtener un lisado celular al que se añade la sonda de DNA, se hibrida a 72ºC durante 1 h, se precipita y se lava el híbrido DNA/RNA y se cuenta la cantidad de radiactividad retenida. Detección de micoplasmas mediante PCR. Se han propuesto diversos métodos para la detección de micoplasmas mediante PCR, y se han comercializado kits, como el producido por la ATCC que permite detectar 5 especies de micoplasmas responsables del 95% de las contaminaciones. En el laboratorio se emplea un método de detección mediante PCR que se basa en el descrito por Wong-Lee y Lovett (1998). Empleando una sola pareja de cebadores correspondientes al RNA 16s de 8 especies de micoplasma (M.hyorhinis, M.arginini, M.pneumoniae, M.fermentans, M.orale, M.pirum, Acholeplasma laidlawii y Spiroplasma mirum). Protocolo: Secuencias de los cebadores: Mico1: GGC GAA TGG GTG AGT AAC ACG Mico2 : CGG ATA ACG CTT GCG AC TAT G Concentración de trabajo de los cebadores 10 pmol/μl Condiciones de PCR: 95ºC 1 min, (95ºC 1 min, 55ºC 1 min, 72ºC 1,30 min) 35 ciclos, 4ºC mantenido Tamaño esperado 0,5 kb Página 8 de 19

9 Para la eliminación de los micoplasmas, en general se recomienda, si el cultivo es reemplazable, eliminarlo, esterilizar todo y volver a empezar. Sólo cuando el cultivo es irreemplazable o importante se recomienda proceder a su eliminación en el cultivo. Para ello hay varias posibilidades: Tratamientos antibióticos. Se ha descrito que la kanamicina (0,1 mg/ml) previene el crecimiento del micoplasma (Fogh y Hacker, 1960), así como la tylocina (6,0 μg/ml). Asimismo son efectivos contra micoplasmas las quinolonas, como ciprofloxacina (Schmitt y col., 1988), y MRA. Las quinolonas inhiben la DNA girasa procariota. Tratamientos con sueros inmunes. El tratamiento del cultivo con sueros anti-micoplasmas se ha revelado como efectivo, pero costoso. Pase por un animal. En el caso de cultivos de líneas tumorales se ha revelado como especialmente útil la inoculación a un animal de experimentación y la recuperación posterior. El sistema inmune del animal limpia el cultivo de micoplasmas. C ontaminación por virus. La contaminación viral es un problema grave pues su prevención y eliminación es realmente difícil. Desde que se descubrió que el suero bovino podía ser una fuente importante de contaminación por diferentes virus (herpesvirus y virus parainfluenza-3) los sueros son controlados rutinariamente, aunque la validez de estos ensayos es limitada. Por ello la única alternativa es el uso de medios libres de suero. Los virus pueden tener un efecto citopático marcado, pero los más peligrosos son aquellos que crecen a baja tasa o en unas pocas células tan sólo. Así, en células de individuos con linfoma de Burkitt, producido por EBV (Epstein-Barr virus), no muestran señales de EBV en cultivo hasta varios pases, cuando solo unas pocas células muestran inmunofluorecencia positiva (Henle y Henle, 1966). La manera más eficaz de detectar la infección por virus es infectar un animal sensible y seguir la aparición de efectos citopáticos Página 9 de 19

10 Técnicas de contaje celular Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas microscópicas dispersas en un fluido. Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión como el porcentaje de éstas que son viables. Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas, desde la relativamente simple cámara de contaje celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la cámara de Neubauer, hasta equipos automáticos de contaje celular como el "Cell Coulter". El principio del contador celular se basa en la medida de los cambios en la resistencia eléctrica que se producen cuando una partícula no conductora en suspensión en un electrolito atraviesa un pequeño orificio. Una pequeña abertura entre los electrodos es la zona sensible a través de la que pasan las partículas que se encuentran en suspensión. Cuando una partícula atraviesa el orificio desplaza su propio volumen de electrolito. El volumen desplazado es medido como un pulso de voltaje. La altura de cada pulso es proporcional al volumen de la partícula. Controlando la cantidad de la suspensión que circula a través del orificio es posible contar y medir el tamaño de las partículas. Es posible contar y medir varios miles de partículas por segundo, independientemente de su forma, color y densidad. Sin embargo, es posible determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos. Nos basta con una cámara de contaje celular, por ej. la cámara de Neubauer, y un microscopio. Una cámara de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensión a medir. El dispositivo presenta unas señales que determinan un volumen conocido (x microlitros). Al contar bajo el microscopio el número de partículas presentes en ese volumen se puede determinar la densidad de partículas en la suspensión de origen. La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0,25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1 milímetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0,1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0,1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0,1 milímetro cúbico, es decir 0,1 microlitro. Si contamos las cuatro áreas sombreadas (L) observando un total de x células entre las cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular será: Concentración en la suspensión (células/ml) = x En la imagen se puede observar el aspecto de una de las regiones marcadas como L y que en el microscopio se ven como una cuadrícula de 16 pequeños cuadrados de 0,25 milímetros de lado. Esta imagen ha sido tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases. Existen numerosos modelos de cámaras de contaje celular adaptadas a su uso en microscopía. En la imagen se puede observar una cámara de Neubauer doble: Página 10 de 19

11 Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. El más común es el de tinción con azul tripán. El azul tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células que presentan roturas en la membrana. Así pues las células que aparecen en la imagen, claramente de color azul, son consideradas no viables. Asimilar células blancas, por exclusión, a células viables es un error pues por este método se sobrevalora la viabilidad de las células en la suspensión, determinando como inviables sólo aquellas con la membrana rota. En la imagen se han representado células vivas como puntos blancos y células muertas (teñidas con azul tripán) como puntos azules. Corresponde a una de las áreas de contaje de la cámara de Neubauer (1 mm 2 ). Existen otros métodos de determinación de la viabilidad celular como el más preciso de la tinción con ioduro de propidio Página 11 de 19

12 Métodos de disgregación de células en placa La disociación tisular y el subcultivo celular representan dos aplicaciones en las que es necesario separar las células entre sí y de un sustrato manteniendo la viabilidad celular. Para conseguirlo es necesario romper la malla de proteínas que forman la matriz extracelular que las mantiene unidas mediante procesos que separen las moléculas proteicas de la matriz extracelular (por ej. secuestrando los iones calcio que permiten la unión), o bien rompiendo proteolíticamente (mediante la acción de proteasas) las mismas proteínas. Generalmente los métodos empleados se pueden clasificar en tres categorías: Mecánicos (por ejemplo cortar, picar, cribar, rascar, etc...). En cultivos celulares se emplean con frecuencia los métodos de rascado ( scrapping ) de la placa para arrancar las células adheridas. Químicos. Generalmente se trata de la adición de soluciones en las que no hay iones divalentes o bien de agentes quelantes de estos iones. En cualquier caso se reduce la concentración de los iones que estabilizan las uniones de las proteínas de la matriz extracelular y de éstas con los receptores celulares. Enzimáticos. Tratamiento del tejido o del cultivo celular con soluciones de proteasas activas (colagenasa, dispasa, tripsina, elastasa, papaína, pronasa, hialuronidasa, etc...) Sin embargo en la práctica se suelen emplear técnicas que combinan dos o tres métodos. La elección de uno u otro procedimiento dependerá fundamentalmente de la naturaleza y cantidad de tejido o cultivo disponible y del uso previsto de las células obtenidas. A continuación se muestra una clasificación de métodos de disgregación celular clasificados según una severidad creciente: Agitación (sacudidas a la placa). Tripsina (0,01-0,5%) en PBS, 5 a 15 min, 37ºC. Prelavado con PBS, Tripsina 0,25% en PBS, 37ºC. Prelavado con EDTA 1mM, Tripsina 0,25 % en PBS, 37ºC. Dos lavados con EDTA 1mM, dejando en EDTA 1 mm, 1 ml/5 cm 2 Prelavado con EDTA, Tripsina 0,25% con EDTA Prelavado con EDTA 1mM, Tripsina 0,25% y colagenasa 200 U/mL en PBS o EDTA/PBS Rascar ( scrapping ) Añadir dispasa (0,1-1 mg/ml) o pronasa (0,1-1 mg/ml) al medio hasta que las células desadhieran. Se separan las células que están en mitosis y las adheridas ligeramente. La mayoría de las líneas celulares. Algunas líneas celulares que se adhieren fuertemente, y muchas líneas celulares a pases bajos. Algunas células en pases bajos fuertemente adheridas. Células epiteliales, aunque algunas pueden ser sensibles a EDTA Células fuertemente adheridas, especialmente epiteliales y algunas tumorales. Hay que tener presente la posible toxicidad del EDTA. Cultivos gruesos formados por múltiples capas de células, especialmente en cultivos productores de colágeno. Todos los cultivos, aunque puede producir daño mecánico y usualmente no produce una buena suspensión celular. Suspenderá la mayor parte de las células, pero requiere la centrifugación de la suspensión para eliminar el enzima no inactivado por el suero. Puede ser dañino para algunas células Página 12 de 19

13 El laboratorio de cultivo celular. La característica principal que define al laboratorio de cultivo celular es el mantenimiento de la asepsia. La tasa de crecimiento de las células en cultivo es muy inferior al de los contaminantes habituales: hongos, levaduras, bacterias y micoplasmas, y por ello para el mantenimiento del cultivo será vital evitar la aparición en éste de cualquier microorganismo indeseado. El área de trabajo para realizar cultivos debe instalarse en una parte del laboratorio tranquila, alejada de las vías de paso y a ser posible dedicada exclusivamente al cultivo de células. La solución ideal es disponer de una habitación aislada. Las aparición de cabinas de flujo laminar redujo las necesidades de aislamiento del área de trabajo pero aún así es recomendable mantener un gradiente de esterilidad, desde el medio exterior o laboratorio general al interior de las cabinas de flujo donde se manipularán los cultivos y del incubador donde se mantendrán. Las necesidades de asepsia dependen del tipo de material que se va a procesar en el laboratorio. Esto define dos tipos de contención y de área de trabajo diferentes: el laboratorio de cultivo de tejidos general, para la manipulación de cultivos no patógenos se instalará preferentemente en una sala aislada y a la cual se le suministrará aire filtrado (normalmente mediante un equipo de filtración y regulador de la temperatura). Esto produce un aumento de presión atmosférica en el interior del laboratorio (típicamente entre 15 y 20 mm de Hg) que impide la entrada de aire no filtrado al área limpia. el laboratorio de cultivo con patógenos supone un nivel de contención superior. A fin de evitar la salida accidental de éstos agentes se filtra el aire que sale de la sala, generando un déficit de presión en el interior de ésta. El aire sale siempre estéril. En el laboratorio de cultivo celular propiamente dicho se encuentran los siguientes tipos de instrumentos: Las cabinas de flujo laminar. Su función es la de mantener un área libre de partículas, especialmente de posibles contaminantes (bacterias, levaduras,...) que puedan acceder al cultivo. Esto se consigue mediante un dispositivo mecánico que fuerza el paso del aire a través de un filtro de gran superficie (filtro HEPA) situado o bien en el techo (flujo vertical) o en la pared frontal (flujo horizontal) y que con una eficiencia del % retiene las partículas por debajo de un cierto calibre que es en general de 0,2μm. El flujo del aire es laminar, sin turbulencias en las que puedan quedar retenidas partículas contaminantes. El flujo laminar se asegura tanto por la gran superficie del filtro HEPA como por la velocidad constante del aire, como por la ausencia de fuentes intensas de calor (mecheros bunsen) en el interior de las cabinas, generadores de intensas corrientes de convección. Los diferentes tipos de cabinas de flujo laminar se diseñan con diferentes propósitos: Protección personal: protección del personal de los posibles agentes dañinos del interior de la cabina. Protección del producto, experimento o cultivo que se encuentra en el interior de la cabina de los contaminantes exteriores o de la contaminación cruzada con otros productos o cultivos situados en la misma cabina. Protección medioambiental: evitar la salida al medio ambiente de productos o agentes contaminantes. Las cabinas de flujo laminar horizontal son muy adecuadas para una buena protección del producto, pero no son adecuadas para el trabajo con materiales peligrosos o con algún tipo de riesgo pues el operador queda completamente expuesto. En las cabinas de flujo vertical, más sofisticadas, se segura una buena protección del producto, y, dependiendo de su diseño se puede asegurar una protección total del operador. Son por ello más adecuadas para el trabajo con agentes peligrosos. Cabina de flujo laminar horizontal Cabina de flujo laminar vertical Dependiendo de la importancia que se le conceda a cada uno de estos factores en el diseño de la cabina se trata de cabinas de clase I, II o III. Cabina de clase I. Se trata de una unidad de contención parcial adecuada para la manipulación de agentes de bajo riesgo, donde existe una necesidad de protección del operario y del medio pero no del producto. Este es el tipo de cabinas normalmente denominadas "de gases", y no son de uso común en el laboratorio de cultivo de tejidos Página 13 de 19

14 Cabina de clase II. Este tipo de cabinas protegen el producto, al personal y al medio ambiente. En general las cabinas de clase II se describen como un equipo de protección con un panel frontal de acceso y que mantienen un flujo laminar estable en el interior, con una filtración HEPA para el aire recircularizado en cada ciclo y una filtración HEPA del aire exhausto (de salida al medio). Los sucesivos diseños que se han realizado para cubrir necesidades diferentes permiten clasificar asimismo las cabinas de tipo II en tres subclases: Tipo A. En este tipo el 30% del aire es eliminado en cada ciclo y el 70% es recircularizado. El escape al medio de los agentes potencialmente peligrosos se previene mediante una corriente de aire entrante en una rejilla frontal. Tipo B. Se trata de una cabina de flujo laminar para uso general y en ella se recirculariza sólo el 30% del aire en cada ciclo, eliminándose el 70% del aire restante. Tipo 100% exhausto. Se trata de una cabina en la que el 100% del aire de cada ciclo es eliminado hacia dispositivos que puedan retener los posibles agentes peligrosos. Este tipo de cabinas se emplean fundamentalmente en laboratorios de toxicología en los que se requieren áreas de contención limpias y eliminación del aire posiblemente contaminado. Las diferencias entre estos tres subtipos se refieren especialmente a la protección del usuario, superior en el caso del tipo A, y a la eliminación de la cabina de posibles contaminaciones de tipo aerosol, no retenibles por el filtro HEPA. La tipo A, que es la más adecuada para el trabajo con agentes patógenos particulados (filtrables) es la menos adecuada para el trabajo con vapores o aerosoles peligrosos. Asimismo se ha de tener en cuenta que el funcionamiento correcto para la protección del producto y del personal depende de una correcta calibración del instrumento, especialmente de las velocidades respectivas de entrada de aire en el sistema y de flujo vertical. El punto de calibración o ajuste es dependiente del instrumento y debe ser realizado por personal especializado cada 6 a 9 meses de funcionamiento para asegurar la protección al usuario. Cabina de clase III. Se trata de una cabina de seguridad, estanca, para el trabajo con agentes biológicos de alto riesgo. Permite mantener al agente patógeno en un ambiente completamente estanco. Permiten controlar tanto los contaminantes particulados como aerosoles y contaminantes gaseosos mediante sistemas de filtración y disolución de éstos Página 14 de 19

15 Incubadores. Se trata de equipos comunes a la mayor parte de los laboratorios de biología (estufas, baños termostatizados,...) con la excepción del incubador de CO 2, y del incubador con "roller". Las células en cultivo son capaces de soportar sin daños importantes variaciones de temperatura, siempre que sean por debajo de la temperatura corporal del animal del que proceden. Así pues las células humanas soportan incubaciones a 4ºC durante días y pueden ser congeladas a -196ºC durante años (con sustancias preservantes). Sin embargo no sobreviven más de unas pocas horas a variaciones de 2ºC por encima de 37ºC. Las células procedentes de animales poiquilotermos soportan mejor un amplio rango de temperaturas de incubación. Las células de homeotermo suelen crecer bien entre 33ºC y 37ºC, pero en ese margen presentan importantes variaciones en su tasa de crecimiento. En un incubador de células es por tanto más importante la consistencia de la temperatura (invariabilidad durante prolongados periodos de tiempo, con oscilaciones inferiores a 0,5ºC) que su precisión a fin de mantener a las células en condiciones en las que las tasas de crecimiento sean constantes. Por ello se deben usar incubadores con movimiento de aire forzado en el interior, y colocar los contenedores de células sobre estanterías agujereadas y nunca sobre el fondo o las paredes del incubador. Las necesidades de asepsia en el incubador son considerablemente menores que en el área de trabajo (cabina de flujo laminar) pero sin embargo es muy recomendable mantener una estricta limpieza, desinfección periódica del incubador, y especialmente no introducir, o eliminarlos inmediatamente, cultivos contaminados en el incubador. Para determinar el número y tipo de los incubadores requeridos se tendrá en cuenta: el tipo de cultivos a realizar: primarios o de líneas celulares estables. Es conveniente no cultivar en el mismo incubador cultivos primarios con líneas celulares estables, pues los primeros son una importante fuente de contaminación. la especie y el tipo de células a cultivar. Es importante la determinación exacta de la temperatura de incubación para la que se tendrá en cuenta la temperatura corporal del animal del que proceden las células, así como cualquier variación regional de temperatura (la piel suele tener una temperatura inferior). Algunos autores sugieren incorporar asimismo un factor de seguridad a la temperatura de incubación. Por ejemplo para la incubación de células humanas sugieren el cultivo a 36.5 ºC, cercano al valor de la temperatura corporal pero un poco inferior para mayor seguridad. Esto es en la actualidad innecesario en los incubadores modernos, capaces de regular la temperatura de incubación con gran precisión. Así pues serán necesarios tantos incubadores como diferentes temperaturas de incubación se precisen. Incubador de CO 2. El mantenimiento de la temperatura en una atmósfera con una tensión controlada de CO2 y adicionalmente de humedad elevada es el objetivo del incubador de CO 2. Un incubador moderno dispone de: dispositivos de control de temperatura, con un termostato de seguridad que desconecta la función en caso de anomalía. La estabilidad de la temperatura es una característica esencial del incubador, y por ello suelen estar equipados con camisas de agua ('water jacketed') que incrementan notablemente la inercia térmica. Como consecuencia la estabilización de un incubador puede tardar varios días. dispositivo de inyección de una mezcla de aire y CO 2, en la proporción deseada, entre el 4 y el 7%. El CO 2 de elevada pureza se suministra en botellas presurizadas, y se mezcla en el dispositivo de inyección. El control de la mezcla se realiza fundamentalmente mediante un dispositivo IRGA ("infra-red gas analyzer"). En incubadores modernos este dispositivo analiza constantemente el porcentaje de CO 2 presente en la cámara de incubación, y realiza las correcciones necesarias. Un problema usual del dispositivo de medida de CO 2 es la pérdida de calibración que se produce periódicamente. Para evitarlo algunos fabricantes dotan al sistema de un mecanismo de autocalibración periódica (basado en la toma de una muestra de aire exterior que se considera tiene un valor determinado de CO 2 ). dispositivo de control de la humedad ambiente. Para mantener el cultivo se requiere una humedad ambiente elevada, a fin de reducir la evaporación de agua del medio de cultivo. En los incubadores menos sofisticados esto se consigue mediante bandejas de agua en el fondo del incubador. Este recurso es peligroso pues son una fuente importante de contaminaciones al convertirse a los pocos días en caldos de cultivo. En los instrumentos más modernos se dispone de dispositivos que controlan la humedad atmosférica, inyectando agua estéril y filtrada. dispositivo de recircularización de aire. Es importante una recirculación del aire en el interior del incubador, a fin de homogeneizar la temperatura en su interior. Si además en el circuito de circulación de aire se intercala un filtro HEPA se consiguen eliminar las posibles partículas contaminantes, y se asegura la esterilidad del ambiente Página 15 de 19

16 Las condiciones del cultivo (temperatura, humedad atmosférica y niveles de CO 2 ) son características de cada línea celular. El nivel de CO 2 se establece para mantener el equilibrio carbonato-bicarbonato en el medio de cultivo, habitualmente al 5%. Incubadores tipo "roller". Se trata de un incubador o estufa, en el interior del cual se ha instalado un "rotor" de baja velocidad. Se utiliza para mantener cultivos en botellas cerradas (no requieren CO 2 ). La finalidad es disponer de una gran superficie para la adhesión de las células. En estos instrumentos se incuban las células en el interior de roller bottles, botellas con una gran superficie de crecimiento. Incubador tipo roller Roller bottles Instrumentos ópticos de observación: microscopio de contraste de fases invertido. El control morfológico del cultivo se realiza mediante el uso de un microscopio. El hecho de que las muestras a observar se encuentren en recipientes de un cierto grosor (más de 3 cm en el caso de frascos de Roux de 250 ml) hace que un microscopio convencional no sea adecuado (por su pequeña distancia frontal), por lo que se han desarrollado microscopios de diseño original, en los cuales la fuente de iluminación y los objetivos se encuentran invertidos respecto a la platina de un microscopio óptico convencional. La segunda característica que condiciona el instrumento óptico es su ausencia de color, es decir se trata de muestras vivas y con poco contraste. El microscopio se equipa con el dispositivo de contraste de fases (diafragmas anulares a nivel del condensador y placa de fases entre las lentes del objetivo). De esta forma el contraste de la imagen aumenta y la calidad obtenida es muy superior Página 16 de 19

17 Es de gran utilidad disponer asimismo de un dispositivo de captación de imágenes, fotográfico o de video acoplado al microscopio a fin de documentar el estado de los cultivos. Congeladores e instalación de criogenia (depósito de N 2 líquido). Es recomendable que los congeladores y la instalación de criogenia estén en recintos separados a la unidad de cultivo propiamente dicha pues los ventiladores y compresores son una fuente importante de turbulencias y suciedad en el laboratorio. Es preciso el almacenamiento de soluciones y células a diferentes temperaturas, para lo que se requiere: neveras (4ºC) para el almacenamiento de medios, PBS,... congeladores de -20ºC para el almacenamiento de suero, aditivos (glutamina, antibióticos) y soluciones enzimáticas (tripsina, colagenasa,...). congeladores de -80ºC para el almacenamiento a largo plazo de los aditivos del medio (suero, glutamina, antibióticos,...) y de sustancias especialmente sensibles (factores de crecimiento, mitógenos, inductores,...). unidad de almacenamiento en nitrógeno líquido (-196ºC), para el almacenamiento de las líneas celulares. Equipo de esterilización: autoclave y equipo de filtración. La necesidad de asepsia para el cultivo de tejidos se extiende no sólo al medio en que se realiza el trabajo sino muy especialmente a los recipientes en que se realiza el cultivo, a los medios líquidos o sólidos, y a los instrumentos que puedan entrar en contacto con éste en algún momento de su manipulación (pipetas, puntas de pipeta automática, pinzas, tubos, material variado de vidrio...). Para esterilizar todo este material, de variada naturaleza se emplean una serie de métodos: irradiación con radiación gamma o rayos X, esterilización por gas, autoclavado, filtración,... En el laboratorio general de cultivo de tejidos se suele disponer de: equipo de filtración y autoclave. La esterilización por gas, y la irradiación son técnicas propias de grandes instalaciones, por ejemplo hospitalarias o industriales. Equipos de filtración. En la actualidad se dispone de unidades de filtración estéril muy recomendables para el trabajo rutinario. Sin embargo, su elevado coste por unidad hace que en muchos casos aún se empleen unidades reutilizables. Estos equipos de filtración constan o bien de una fuente de vacío conectada a un kitasato dotado de una unidad de filtración esterilizada por autoclavado, o bien de una bomba peristáltica que fuerza el flujo de solución a través de una unidad de filtración hermética. En ambos casos la esterilización se produce al atravesar la solución un filtro de poro 0.22 μm Página 17 de 19

18 Autoclave. Un autoclave es un instrumento que permite la esterilización por calor tanto de sólidos como de líquidos. La esterilización se realiza habitualmente a 121ºC, 1 atmósfera de sobrepresión durante un tiempo superior a 20 min. Un autoclave de uso normal en el laboratorio de cultivo de tejidos suele disponer de temporizador y regulador de presión, y en algunos casos de un ciclo de secado para permitir secar el material sólido (material de vidrio, instrumentos quirúrgicos, tubos,...). Mechero Bunsen. Otros instrumentos. Además del equipo antes citado el laboratorio de cultivo de tejidos deberá estar equipado con otros instrumentos que, o bien no son imprescindibles para un laboratorio de tamaño pequeño (por ej. el contador electrónico de células), o bien son instrumentos que forman parte de un laboratorio de uso más general (centrífugas, equipo de purificación de agua, balanzas, ph-metro, pipeteadores...). Centrífugas. En el laboratorio de cultivo de tejidos es necesario disponer de una centrífuga refrigerada, preferentemente con posibilidades de usar en ella desde tubos de pequeño volumen (1 a 2 ml) a botellas de gran capacidad (250 a 500 ml). Normalmente, para la mayor parte de las aplicaciones bastará con un instrumento que desarrolle hasta 2000 g. La centrífuga se ha de instalar dentro de lo posible alejada de las cabinas de flujo laminar, para evitar las turbulencias de aire que genera. Contador electrónico de células ("cell counter"). Un contador electrónico de células es un instrumento capaz de contar y medir partículas en suspensión. Este instrumento fue comercializado por Coulter Electronics, y a pesar que posteriormente se han desarrollado métodos alternativos es aún hoy en día el mecanismo más empleado. El sistema está formado por los siguientes elementos: Página 18 de 19

19 dos electrodos, uno en el interior de un tubo con un pequeño orificio que se introduce en la suspensión de partículas a contar, y un segundo electrodo que se introduce directamente en dicha suspensión. El tubo con el orificio está conectado a un manómetro de mercurio y a una bomba. El manómetro controla mediante el desplazamiento del mercurio la conexión y desconexión de los electrodos. un amplificador electrónico de la señal, un analizador de altura de los pulsos, y una escala, conectados a los electrodos. Cuando la válvula que controla el manómetro se abre 0.5 ml de la suspensión entran en el interior del tubo por el pequeño orificio. Durante ese tiempo los electrodos están conectados y registran y transmiten al equipo de amplificación y análisis de la señal las oscilaciones de resistencia que detectan. Cada vez que una célula atraviesa el orificio se produce una variación de la resistencia proporcional al tamaño. Estos datos se registran y se analizan. Equipo de purificación de agua. Es de gran importancia en la preparación de los medios, de los aditivos, o en cualquier solución que pueda estar en contacto con el cultivo, una absoluta esterilidad y ausencia de sustancias que puedan provocar alguna alteración al cultivo. Por ello se utiliza siempre agua de la máxima calidad (tipo MilliQ) obtenida mediante equipos de doble destilación o de intercambio iónico y filtración. Es muy importante la eliminación de apirógenos, y restos de materia orgánica. Pipeteadores. Se trata de dispositivos o instrumentos para el trasvase o medición de fluidos. Los de uso común en el laboratorio como las pipetas automáticas y las pipetas, pero con la salvedad del uso de bombas acopladas a la pipeta, manuales o eléctricas que permiten la aspiración mecánica del fluido. Importante para mantener la asepsia y al mismo tiempo para la protección del operador. El aire bombeado es filtrado previamente. Pipeteador automático Sistema de aspiración de líquidos Página 19 de 19