CULTIVO DE CÉLULAS EN LA PRODUCCION DE BIOLOGICOS M.V. ROQUE FERNANDEZ VERA

Transcripción

1 CULTIVO DE CÉLULAS EN LA PRODUCCION DE BIOLOGICOS M.V. ROQUE FERNANDEZ VERA

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3 Introducción histórica. Hooke, Robert ( ), 1º descubrimientos de las células vegetales. El cultivo de tejidos se desarrolló a finales del siglo XIX aplicado a técnicas de embriología. Roux : 1885 mantuvo células de embrión de pollo en solución salina durante unos días. Burrows y Carrel Utilizaron células de mamífero, perros, gatos, cobayos, y tumores sólidos. Rous y Jones (1916) emplearon extractos con tripsina disociar células y embriones, estableciendo el 1º cultivo celular Grey y col.(1952) establecen la 1ª línea celular continua, bien conocidas las células HeLa. Eagle (1955) 1ª investigación sistemática requerimientos nutritivos de las células en cultivo Hayflick y Moorhead (1961)1ª vez antibióticos para prevenir la contaminación de los cultivos de fibroblastos Sato y col.(76-82) publicaron trabajos donde líneas celulares requieren mezclas distintas de hormonas y factores de crecimiento en medios libres de suero. Los últimos años la aplicación de tecnologías en cultivo celular hay grandes avances para comprender los mecanismos intracelulares e intercelulares estableciendo co-cultivos,... Actualmente ha revolucionado el manejo de cultivos celulares a través de la clonación, y los trabajos con células madre:

4 Introducción histórica PERU. En Perú se realiza trabajos con tejidos de animales desde la década de los 50 donde se inocula animales con virus como para la producción de vacuna antivariólica. Igualmente se trabaja vacuna antirrabica tipo FERMI inoculando corderos y tipo SEMPLE donde se inocula conejos posteriormente se inocula ratones lactante vacuna antirrábica tipo FUENZALIDA Y PALACIOS Entre los años 70 y 80 se trabaja con cultivos primarios la vacuna ANTIAFTOSA donde se usa epitelios linguales de bovinos y adyuvada con Hidróxido de Aluminio. A finales de los 70 se construye el laboratorio de vacunas virales y un equipo de profesionales medicos veterinarios se especializan en el centro de referencia de PANAFTOSA BRASIL en la producción de vacuna aftosa en cultivos celulares células BHK21 En 1983 se inagura el LVV y se comienza con la producción de vacuna anti aftosa trivalente ( virus O,A,C ) oleosa En1984 se propone la producción de vacuna antirrábica en CC (cel BHK) uso veterinario a partir 1986 se produce el primer lote de vacuna, y hasta la fecha se viene produciendo tratando de cubrir la demanda nacional. En 1998 se trabaja lotes piloto de vacuna antirrábica en células VERO para humanos

5 CULTIVO DE CELULAS EN PRODUCCION DE BIOLOGICOS Aplicaciones del cultivo celular. Los estudios Abarcan muchas disciplinas. Actividad intracelular. trascripción de DNA, síntesis de proteínas, metabolismo energético. Flujo intracelular. ej. ensamblaje y desensamblaje de los diferentes componentes intracelulares, movimientos del RNA : núcleo-citoplasma, movimiento de proteínas,... Ecología celular. estudia necesidades nutricionales, infecciones, transformación celular (inducidas por virus o agentes químicos), cinética de población celular,... Interacciones celulares. Procesos de inducción embrionaria, cooperación metabólica, inhibición por contacto o por adhesión, interacciones célula-célula.

6 Cultivo de Células en Producción de Biológicos CULTIVOS CELULARES Áreas de Investigación Virología :condiciones de cultivo, virus animales y plantas, producción vacunas antivirales. Investigación del Cáncer Inmunología. introducción de técnicas de fusión celular en producción de anticuerpos monoclonales, y el análisis genético de la célula somática. Ingeniería de proteínas. producción de proteínas en líneas celulares : interferón, insulina, hormona de crecimiento,... Estudios de interacción y señalización celular,. Comprende el estudio de los receptores y de las vias de translocación de la señal. Aplicaciones diagnósticas. En medicina y farmacología destacan el análisis cromosómico de células crecidas a partir de muestras de amniocentesis, detección de infecciones virales, ensayos de toxicidad,... Aplicaciones médicas : mantenimiento y producción de tejidos para transplante. Aplicaciones industriales y agronómicas : producción por reproducción "in vitro" de clones de plantas de interés comercial,... y otras muchas.

7 Equipos en el laborataorio de CC Cabinas de flujo laminar (áreas de trabajo y de contención estéril). Incubadores : baños termostatizados, incubadores de CO2, Incubadores 'roller',... Instrumentos ópticos de observación del cultivo : microscopio invertido de contraste de fases, de fluorescencia,... Instalación de criogenia (tanques de N2 líquido) y congeladores Equipo de esterilización : autoclave, equipos de filtración,... Otros instrumentos : centrífugas, contadores electrónicos (Cell Counters), equipo de purificación de agua, balanzas, ph-metro, pipeteadores...

8 NORMAS DE SEGURIDAD TECNICAS DE LABORATORIO ESTANDAR Y NORMAS DE HIGIENE PERSONAL: BPM, BPL, BPA, desarrollo procedimientos, minimizar riesgos biológicos, químicos y físicos. El lavado de manos inicio y fin jornada y el uso de indumentaria de protección es obligatorio para el manejo de cultivos y agentes biológicos. Usar sustancias antimicrobianas, secar con toallas de papel o aire. No comer, beber, fumar, aplicarse cosméticos ni guardar o almacenar alimentos y bebidas en el área de trabajo del laboratorio. No pipetear con la boca. El ingreso a las zonas restringidas deben efectuarse únicamente a través de las instalaciones de cambio de ropa y ducha. Vacunarse..

9 CULTIVOS CELULARES CLASES DE CULTIVOS CELULARES CULTIVOS PRIMARIOS CULTIVOS EN MONOCAPA CULTIVOS EN SUSPENSION

10 CULTIVO DE CELULAS EN PRODUCCION DE BIOLOGICOS Cultivo primario: células, tejidos u órganos tomados directamente de un animal. Cultivo de órganos, explantes: mantenimiento de órganos o parte de órganos in vitro. Cultivo de tejidos: mantenimiento de tejidos in vitro. Cultivo de células: mantenimiento de células dispersas. Líneas celulares: células mantenidas por subcultivos sucesivos comenzando por un cultivo primario. Cultivos continuos: células que han logrado sobrevivir a muchos subcultivos. Expectativa de

11 CULTIVO DE CELULAS EN PRODUCCION DE BIOLOGICOS BHK: Fibroblastos de riñón de hamster sirio dorado CrFK: Fibroblastos de riñón de gato doméstico MDCK: Epitelio de riñón canino (Cocker Spaniel) CHO: Epitelio de ovario de hamster chino VERO: Fibroblastos de riñón de mono verde africano HeLa: Epitelio tumoral de cuello uterino humano MDBK: Epitelio de riñón de bovino adulto HUVEC: Endotelio de vena umbilical humana FHBE: Endotelio de corazón fetal bovino Etc., etc., etc.

12 CULTIVO DE CELULAS EN PRODUCCION DE BIOLOGICOS Sigla Nombre u organismo Ciudad, país Nº de cultivos ATCC American Type Culture Collection Minassas, USA 800 DSMZ Human and Animal Cell Cultures Braunschweig, Alemania 500 ECACC European Collection of Cell Cultures Salisbury, Wiltshire, UK 1000 GEIMM Istituto Giannina Gaslini Genova, Italia 2300

13 CULTIVOS CELULARES INSTALACIONES

14 CULTIVOS CELULARES EQUIPOS

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16 CRIOPRESERVACION

17 MEDIOS DE CULTIVO CELULAR COMPONENTES: Agua Sales Glucosa Ácidos grasos Vitaminas Suero Péptidos Micro y oligoelementos Aminoácidos esenciales Factores de crecimiento Otro regulador de ph Indicador de ph Antiespumante Antibióticos?

18 MEDIOS DE CULTIVO CELULAR CONDICIONES DE UN MEDIO CUALIDADES: Específico para la célula a cultivar Nutritivo ph adecuado Capacidad buffer Isotónico Estéril

19 MEDIOS DE CULTIVO CELULAR Medio Basal de Eagle (BME). Medio con aminoácidos esenciales. Se suplementa con suero bovino fetal al 10 %. Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM). aminoácidos en mayor concentración que el BME. adición de suero (10 %). R.P.M.I crecimiento de linfoblasto y líneas celulares leucémicas en suspensión. Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM). 4 V AA y vit. selección de hibridomas. Modificación de Iscove del medio DMEM (IMDM). Es un medio muy completo que incluye en su formulación albúmina bovina, transferrina, selenito, et... linfocitos libre de suero. McCoy 5A. L.C diploides tanto de rata como humanas. Medio L-15 de Leibovitz. cultivo de virus. Medio F-10 de Ham. L.C. humanas, se suplementan con proteínas, hormonas metales como Fe, Cu, Zn. Cé. amnióticas. Medio F-12 de Ham. medio libre de suero. Medio 199. usado para cultivo de células no diferenciadas y estudio de cromosomopatías.

20 MEDIO ESENCIAL MINIMO MEM Composición Química: L-arginina. HCL mg/l Colina cloruro 1.00 mg/l L-cistina. 2HCL mg/l Acido fólico 1.00 mg/l L-glutamina. D- glucosa mg/l mg/l Inositol Niacinamida mg/l mg/l L-histidina mg/l Bicarbonato de sodio al 7.5% ml/l L-isoleusina mg/l Piridoxal. HCL 1.00 mg/l L-leucina mg/l Riboflavina 0.10 mg/l L-lisina mg/l Tiamina HCL 1.00 mg/l L-metionina mg/l D- Calcio pantotenato 1.00 mg/l L-fenilalanina mg/l Glutamina al 3% ml/l Sulfato de magnesio. 6H2O mg/l L-treonina mg/l Cloruro de potasio mg/l L-triptófano mg/l Cloruro de sodio mg/l L-tirosina 2Na.2H2O mg/l Fosfato dibasico de sodio mg/l L-valina Rojo de fenol mg/l mg/l. Penicilina Estreptomicina UI mg/l

21 CULTIVOS CELULARES SISTEMA DE CULTIVOS CELULARES CULTIVOS ESTACIONARIOS CULTIVOS ROTATIVOS CULTIVOS EN SUSPENSION

22 ESTACIONARIO ROTATIVO

23 PRODUCCION DE BIOLOGICOS ROTATIVO

24 ROTATIVO

25 ROTATIVO Y SUSPENCION

26 PRODUCCION DE BIOLOGICOS MICROPORTADORES

27 RECUENTOCELULAR

28 CULTIVO DE TEJIDOS CELULAS MDCK CELULAS BHK RFV

29 CULTIVOS CELULARES PRODUCCION DE BIOLOGICOS VACUNA ANTIVARIOLICA VACUNA ENCEFALITIS EQUINA VACUNA ANTIAFTOSA (FRENKEL) VACUNA ANTIAFTOSA (OLEOSA) VACUNA HEPATITIS VACUNA INFLUENZA VACUNA ANTIRRABICA OTRAS VACUNAS

30 PRODUCCION DE VACUNA ANTIRRABICA

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32 VACUNA EN CULTIVOS CELULARES

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34 INACTIVACION DE ANTIGENO

35 CLARIFICACION DE ANTIGENO

36 ANTIGENO RABICO PARA FORMULACION

37 ENVASE DE LA VACUNA

38 TAPONADO Y PRECINTADO

39 CONTROL DE VACUNAS Hay factores importantes en la fabricación de Vacunas Antirrábicas, para el control se emplean ratones adultos de (11-14 gr.) y lactantes los cuales deben provenir de criaderos garantizados, debiendo tener buenas condiciones de manejo, alimentación y salud. Los controles son decisivos, para poder usar un biológico, entre ellos tenemos ESTERILIDAD SEGURIDAD GENERAL INOCUIDAD POTENCIA (NIH) ESTABILIDAD

40 VACUNA DE USO VETERINARIO Vacuna Antirrábica en CC RFV

41 Vacunación Antirrábica

42 CANTIDAD EN FRASCOS ENTREGAS REGISTRADAS DE LA VACUNA ANTIRRÁBICA CANTIDAD

43 CANTIDAD EN DOSIS 3,000,000 ENTREGAS REGISTRADAS DE LA VACUNA ANTIRRÁBICA ,500,000 2,241,820 2,383,800 2,249,200 2,000,000 1,500,000 1,389,450 1,260,640 1,290,600 1,123,260 1,284,960 CANTIDAD 1,000, , , ,

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46 «EL TRABAJO INDIVIDUAL GANA UNOS PASOS PERO EL TRABAJO EN EQUIPO LOGRA LAS METAS PRODUCIMOS PARA PROTEGER LA SALUD» GRACIAS LVV