Tipos de cultivos celulares Generalidades

Transcripción

1 Tipos de cultivos celulares Generalidades Curso Introducción al Cultivo de Células Eucariotas Año 2015 Dra. Romina Manarin

2 Wilhem Roux 1885 Y así comenzó todo Alexis Carrel 1913 Ross Harrison 1907

3 Cultivo celular Abarca al conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células in vitro, conservando al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas.

4 Existen 3 formas principales de iniciar un cultivo celular: CULTIVO DE ÓRGANOS EXPLANTES PRIMARIOS CÉLULAS DISGREGADAS

5 Cultivo de órganos El tejido se coloca sobre una rejilla situada en la interfase líquido-gas de un medio del que obtiene los nutrientes. Representa una buena réplica del tejido de origen ya que se conservan las interacciones histológicas. El crecimiento es limitado. Se necesita un nuevo explante para cada experimento.

6 Explantes primarios Constituidos por fragmentos pequeños de tejidos u órganos que se adhieren a una superficie en la que generalmente crecen las células de la periferia del explante. Útil para pequeñas cantidades de tejidos, como biopsias de piel. explante Cultivo de un Explante primario de carcinoma de piel de ratón crecimiento temprano de células (3 dpe) crecimiento celular luego de la remoción del explante (7dpe)

7 Cultivo de células disgregadas Este tipo de cultivo está formado por células dispersas disgregadas de un tejido vivo, de un cultivo primario, o de una línea celular, mediante distintos sistemas mecánicos, químicos o enzimáticos. Las células crecen en suspensión o adheridas a una superficie. Generalmente son cultivos que contienen un único tipo de célula y éstas suelen ser homogéneas genéticamente. Es el tipo de cultivo más utilizado en la actualidad debido a su capacidad de propagación, es decir de crecimiento mantenido.

8 Propiedades de los tipos de cultivos

9 Mecanismos de disgregación Enzimática 1.tripsina fría 2.tripsina caliente 3.colagenasa Mecánica

10 Tripsina caliente Pequeñas porciones de tejido se incuban con tripsina a 37 C y las células disociadas deben recolectarse por centrifugación cada media hora. La tripsina se neutraliza con suero en medio de cultivo.

11 Tripsina fría Las porciones de tejido se incuban en tripsina a 4 C durante 6-18 hs permitiendo la penetración con una mínima actividad tríptica y la digestión se puede hacer en un tiempo corto de min a 37 C.

12 Disgregación por colagenasa

13 Disgregación mecánica SCRAPING O RASCADO DISGREGACIÓN CON LA JERINGA TAMIZADO PIPETEO

14 Inicio de un cultivo celular Puede derivar del crecimiento de las células disgregadas. El cultivo primario es lo primero de una serie de procesos selectivos que finalmente darán origen a una línea celular.

15 Los cultivos celulares son los más utilizados MONOCAPA SUSPENSIÓN células hematopoyéticas, células madres

16 Cultivos primarios CULTIVO PRIMARIO Cuando las células o tejidos procedentes de un ser vivo crecen sin haber pasado previamente por una fase de crecimiento in vitro. CULTIVO SECUNDARIO Cuando el cultivo procede de una fase previa de crecimiento in vitro LÍNEA CELULAR

17 Subcultivos en monocapas

18 Tripsinización

19 Cuándo hacer un Subcultivo o Pasaje 1. Alta densidad del cultivo. 2. Agotamiento del medio de cultivo. 3. Tiempo desde el último pasaje.

20 El origen de una línea celular

21 Algunos Conceptos LINEA CELULAR- CEPAS Con los sucesivos pasajes o subcultivos, un cultivo primario forma una línea celular. Este término implica la presencia de varios linajes celulares de fenotipos similares o distintos. Así, al seleccionar uno de los linajes celulares por clonado o por separación celular física o por cualquier otra técnica de selección, para tener ciertas propiedades específicas que han sido identificadas en la masa de células del cultivo, esta línea celular se transforma en lo que se conoce como cepa celular (o cell strain).

22 Evolución de una línea celular

23 Líneas celulares finitas y continuas Normalmente, las líneas celulares tienen una vida finita que, según el tipo de célula, se puede prolongar entre 20 y 80 generaciones. Superado ese límite, las células entran en senescencia en la que pierden su capacidad de proliferar, supuestamente por el acortamiento de los telómeros, y mueren. Sin embargo, algunas células (como las células de roedores y las células tumorales) evitan la senescencia y dan lugar a líneas celulares continuas, que crecen indefinidamente. Estas células pueden surgir de forma espontánea (exposición a radiaciones ionizantes o a carcinógenos químicos) o inducida (infección vírica o transfección de ADN) y son el resultado de un cambio genotípico denominado transformación. Las células transformadas se caracterizan porque son inmortales (crecen indefinidamente); su crecimiento es aberrante (se pierde la inhibición por contacto, la limitación de la densidad celular durante la proliferación y la dependencia del anclaje); son malignas (invaden tejidos y dan lugar al crecimiento de tumores); son genéticamente inestables y presentan aberraciones cromosómicas.

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26 Líneas celulares más frecuentemente utilizadas

27 Células en cultivo fibroblastos mioblastos Células de tabaco Células VERO Células RAW Epimastigotes de T. cruzi

28 Ventajas de los cultivos celulares

29 Ventajas de los cultivos celulares

30 Desventajas de los cultivos celulares

31 Desventajas de los cultivos celulares

32 Bancos y colecciones de cultivos celulares Los 2 bancos de líneas celulares más importantes son: - American Type Culture Collection (ATCC) - European Collection of Cell Cultures (ECACC) En Argentina: - Asociación Banco Argentino de Células (ABAC) - Asociación Argentina de Bancos de Tejidos (para transplantes) - Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba (ciquibic)

33 Servicios de ABAC Venta de líneas celulares Control de Micoplasma en Muestras de Células Depósito de Ampollas en Nitrógeno Líquido Manual de ATCC

34 Designación de líneas celulares Las nuevas líneas celulares deberían tener: un código o designación. Por ej. normal human brain, NHB una clase celular o número de línea celular. Si varias líneas celulares fueron obtenidas de la misma fuente. Por ej. NHB1, NHB2, etc.) un número de clon. Por ej. NHB2-1, NHB2-2, etc. el número de duplicaciones de la población ( para líneas celulares finitas), debería ser estimado e indicado después de una barra. Por ej. NHB2/2. el número de pasaje desde el último descongelamiento (para una línea celular continua) Por ej. HeLa-S3/p4). Es esencial que la designación de la línea celular sea única, para evitar confusiones en distintos trabajos de la literatura. Los bancos de células eliminan este inconveniente dando a cada línea celular un número de acceso.

35 Consideraciones al elegir una línea celular Línea celular finita o continua Células normales o transformadas Especie Características de crecimiento Disponibilidad Validación Expresión fenotípica Línea celular control Estabilidad

36 Muchas gracias