Cul$vo Primario de Células. Dra. María Laura Ruiz - Dr. Ismael Barosso IFISE- CONICET

Transcripción

1 Cul$vo Primario de Células Dra. María Laura Ruiz - Dr. Ismael Barosso IFISE- CONICET

2 Cul$vo celular. Definición Conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células in vitro, conservando al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y gené$cas Formas de obtención: Perfusión de órgano específico Disgregación de tejidos Explantes de biopsias Fluidos orgánicos como la sangre

3 Existen dos categorías de cul7vo celular: Cul$vo Primario Línea celular

4 Diferencias entre cul7vo primario y líneas celulares

5 El cul$vo primario se u$liza con preferencia a las líneas celulares cuando se buscan condiciones experimentales más representa$vas del tejido in vivo.

6 Pasos en cul7vo primario 1- Aislamiento del tejido. 2- Disociación de células. 3- Separación de células. 4- Recuento de células viables. 5- Siembra en placa- Incubación.

7 Aislamiento del tejido Asegurarse que el trabajo que realizamos cumple con las normas de bioé$ca. Respetar normas de bioseguridad, especialmente con tejido humano.

8 Disociación de células Técnicas de disgregación enzimá$ca. Técnicas de disgregación mecánica. Técnicas mixtas. Excepción: células hematopoyé$cas

9 Disgregación Enzimá7ca Las técnicas de disgregación enzimá$ca se basan en afectar la unión célula- célula o célula matriz extracelular : Enzimas que degradan las proteínas de unión. Quelantes de calcio como EDTA o EGTA (impiden la adhesión celular dependiente de calcio).

10 Enzimas usadas en la disgregación enzimá7ca Enzimas: - Tripsina - Colagenasa II - Elastasa - Hialuronidasa - DNAsa - Frecuentemente se usan combinaciones de enzimas. - Las preparaciones crudas son más efec$vas: - Mientras más pura menos tóxica. - Mientras más cruda más efec$va debido a la contaminación con otras proteasas.

11 Disgregación Enzimá7ca Empezar con tripsina/edta y luego proceder con enzimas más complejas. Templar o enfriar la tripsina: el frío parece dar mayor can$dad de células vivas pero el calor acelera el proceso de disgregación (exposiciones más cortas). Recordar inac$var y remover la tripsina antes de plaquear las células.

12 Tripsina templada Tripsina templada: para evitar la muerte celular por exposición, colectar células cada media hora. La tripsina templada funciona mejor con grandes can$dades de tejido joven (embriones de pollo) y no tan bien con tejido adulto (con$ene más can$dad de tejido conec$vo).

13 Tripsina fría La tripsina fría: evita el daño por exposición de la tripsina templada. Permite la penetración de la enzima con una ac$vidad enzimá$ca mínima. Se ob$ene mayor rendimiento y mayor supervivencia de las células. Preserva una mayor can$dad de células de diferentes $pos celulares. Es más conveniente.

14 Otros procedimientos enzimá$cos Algunos tejidos como el tejido conec$vo fibroso son resistentes a la tripsina. Colagenasa: par$cularmente tejido conec$vo y múscular. Hialuronidasa: para disolver proteoglicanos. DNAsa: para disolver agregados de DNA de células dañadas.

15 Disgregación Mecánica Se evita el riesgo de daño proteolí$co. Más rápida que la disgregación enzimá$ca: Cortar Tamizar Pasar por jeringa Pipetear

16 Disgregación Mixta. Aislamiento de hepatocitos. La perfusión con colagenasa en dos pasos es la técnica más usada para aislar hepatocitos del tejido hepá$co. Se basa en que el ión calcio es crí$co para el mantenimiento de la adhesión celular. El hígado se perfunde con un buffer libre de calcio, frecuentemente suplementado con un quelante de calcio, para romper las uniones célula- célula dependiente de calcio. En un segundo paso, el hígado es perfundido con colagenasa libre de calcio para romper las uniones célula- matriz extracelular. Luego el hígado se somete a una disgregación mecánica: agitación suave con varilla de vidrio y tamizado.

17 - Recordar: Mantener la suspensión de células en hielo, hasta que puedan sembrarse.

18 Separación de los dis7ntos 7pos celulares Centrifugación: permite separar por diferencia de tamaño. Capacidad de adherencia al vidrio o plás$co. Se emplean an$cuerpos acoplados a colorantes fluorescentes para marcar células específicas adheridas a ellos. Las células marcadas por interacción con el an$cuerpo pueden ser separadas de las no marcadas en un separador de células ac$vado por fluorescencia o cell sorter Etc.

19 Recuento de células. Cámara de Neubauer La fórmula quedará : Concentración (cél/ml)= número de células x número de cuadros x dilución Ejemplo: Para una dilución de 1 : 10. Dilución = 0,1 Para una dilución de 1 : 100. Dilución = 0,01

20 Determinación de la viabilidad celular: Método de exclusión de azul tripán. Se basa en que las células no viables se $ñen de azul porque no son capaces de excluir el colorante

21 Procedimiento: - Se toma una alícuota de la suspensión de células bien homogeneizada. - Se la mezcla con solución de Azul Tripán. - Se carga la cámara de Neubauer. - Se realiza el recuento de células totales, células vivas, células muertas. - Se calcula la viabilidad. - La can$dad de células a sembrar se calcula teniendo en cuenta la cc de células vivas.

22 Siembra Dependencia de Anclaje: - Células ancladas o adherentes (hepatocitos) - Células en suspensión (linfocitos) - Células ancladas o adherentes: Requieren superficie sólida. En general recubierta de alguna sustancia de la matriz extracelular. Agregado de factores de crecimiento y suero.

23 Siembra - Tener en cuenta. El porcentaje de células que sobreviven en cul$vo primario es bajo, por lo tanto al sembrar, u$lizar una mayor can$dad de células que las usadas para líneas celulares. Un medio de cul$vo rico (Ham s F- 12) es preferible a un medio de cul$vo simple (DMEM). Si se requiere suero, con suero fetal bovino se ob$ene mayor supervivencia que con el de caballo o ternero.

24 Cul7vo primario de hepatocitos de rata Perfusión colagenasa - Lavado - Centrifugación - Azul Tripán - Recuento Placa preparada con superficie de colágeno Incubador 37 C - 5%CO2

25 Cul7vo primario de hepatocitos de rata Duración limitada: debido a que luego de un plazo de $empo mayor a 48 hs pierden la mayoría de las funciones metabólicas específicas, incluyendo la expresión de muchas proteínas transportadoras de membrana. La polaridad del hepatocito no se conserva

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28 hjp:// mtodo- simple- y- eficaz- para- aislar- los- macrfagos- de- la- mezcla- de? language=spanish

29 ü Modelo polarizado ü Conserva durante semanas su capacidad biosintética, funcional y metabólica ü Ventajoso para técnicas de Western Blot, estudios de toxicidad, RNAi

30 Aislamiento de hepatocitos Sembrado 4,5 x 10 5 cél/ml en placas de 6 pocillos recubiertas con colágeno, cul7vo 24 hs 2 da capa de colágeno, cul7vo por 48 hs Pre- Tratamientos o Tratamientos Estudios 2D: Localización de Mrp2 (Ez- C1 FreeViewer) y es$mación del ancho canalicular (ImagePro) Estudios 3D: Es$mación del volumen canalicular por reconstrucción 3D de stacks (ImageJ) Estudios por Microscopía Confocal Microscopía de fluorescencia e Image J Estudios Funcionales CMFDA

31 Control Colestásico 1 min 2 min 3 min 4 min 5 min 6 min 7 min

32 Slice Remover Stacks-T-functions Time Series Analazer Tack Reg