POSTER P163 - UICC OSLO
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- Ignacio Robles Herrero
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1 POSTER P163 - UICC OSLO 22 1 EFECTO DE LOS OLIGOELEMENTOS Se, Zn y Mn MAS LACHESIS MUTA EN EL CRECIMIENTO DE CELULAS PANC-1. ESTUDIOS IN VIVO E IN VITRO. EJV Crescenti 1, ES Rivera 2, M Croci 1, GP Cricco 2, GA Martin 2, RM Bergoc 2 1 Instituto de Inmuno Oncología, Buenos Aires. 2 Laboratorio de Radioisótopos. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires. ARGENTINA. INTRODUCCION Hemos informado previamente sobre la acción terapéutica de la combinación compuesta por los oligoelementos Zinc (Zn), Selenio (Se) y Manganeso (Mn) más Lachesis Muta. Esta combinación ha probado ser efectiva in vivo e in vitro en el tratamiento de un adenocarcinoma mamario experimental inducido en ratas (UICC Meeting, 1997). Más aún, el tratamiento con mostró un significativo aumento en la sobrevida de pacientes con carcinoma de colon (UICC Meeting, 1997) y con cáncer de mama (UICC Meeting, 1998). Además de su acción terapéutica, la administración de produce un efecto protector aumentando la tolerancia a altas dosis de quimioterapia y radioterapia (UICC International Meeting, 1997 y 1998).El objetivo del presente trabajo fue investigar in vitro e in vivo el mecanismo molecular de la acción de Se, Zn, Mn y Lachesis muta () empleando células PANC-1 derivadas de carcinoma pancreático humano. MATERIALES Y METODOS Composición de : Zn, Se y Mn 1-6 g/l y Lachesis muta 1-12 g/l. CULTIVO CELULAR: las células PANC-1 (ATCC CRL 1649) fueron incubadas en medio RPMI 1% FCS a 37ºC y en atmósfera de 5% CO2. La proliferación fue evaluada por el método de formación de colonias después de 8 días de cultivo. Tratamiento con : 1 ml por ml de medio de cultivo. INMUNOHISTOQUIMICA: Las células fueron fijadas con metanol, permeabilizadas con Triton.25%, lavadas con PBS e incubadas toda la noche con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-pcna o anti-fos (Promega), y 2º anticuerpo conjugado con fluoresceina o rodamina, respectivamente. MODELO TUMORAL: Tres diferentes grupos de ratones nude (n=1) fueron inoculados s.c. con 3x1 6 células PANC-1. A: Control; B: Preventivo, que recibió diariamente,2 ml s.c. de desde 3 días antes de la inoculación de las células; C: Tratado, que recibió,2 ml s.c. diariamente de a partir de que los tumores desarrollados alcanzaron un diámetro de.6 cm.
2 POSTER P163 - UICC OSLO 22 2 RESULTADOS ESTUDIOS DE PROLIFERACION Nº colonias Proliferación (%) CONTROL 123±11 1 TRATADO 5±6 41 El tratamiento con produce una significativa inhibición de la proliferación de células PANC-1. Los datos representan la media ± SEM de 1 experimentos. Extractos celulares de la línea PANC-1 incubados por 1 h (calle 1) y 2 hs (calle 3), y células PANC-1 tratadas con por 1 h (calle 2) y 2 hs (calle 4) fueron separados por SDS-PAGE, transferidos a membranas PVDF e incubados con Ac anti c-fos humano. La banda específica de proteína c- FOS fue detectada por medio de un kit de quimioluminiscencia. Expresión de proteínas relacionadas con la proliferación en células PANC-1 cultivadas 1 h: izquierda) c-fos en condiciones control, derecha) c-fos en células tratadas con. (Inmunohistoquímica 1x)
3 CICLO CELULAR POSTER P163 - UICC OSLO 22 3 Células (%) Tiempo (hs) G/G1 S G2/M Cells (%) CONTROL Time (hs) G/G1 S G2/M Las células fueron cultivadas sobre portaobjetos con o sin durante 24, 48, 72 o 96 hs. Luego fueron fijadas y teñidas con Feulgen y el contenido de ADN fue evaluado con un Analizador de Video Imagenes. Los resultados obtenidos indicaron que al cabo de 24 hs produce un aumento en el número de células en G2/M con un consiguiente aumento en la proporción de células en la fase S después de 48 hs. TIEMPO DE DUPLICACION Células Tiempo (hs) Control Tiempo de duplicación Control 36 horas 27 horas Las células fueron sembradas en placas de 6 pozos con y sin. Luego de 24, 48 o 72 hs de cultivo fueron contadas en una cámara de Neubauer. El gráfico representa el número total de células a diferentes tiempos de cultivo. Las curvas experimentales fueron ajustadas con un programa de regresión no-lineal de acuerdo con la siguiente ecuación: Nº células = Nº células t= x e kt. El tiempo de duplicación de determinó como T= ln2/k.
4 POSTER P163 - UICC OSLO 22 4 MODELO TUMORAL EN RATON NUDE PARAMETROS TUMORALES Parámetros Control Preventivo Tratado INCIDENCIA TUMORAL (%) PERIODO de LATENCIA (días) 1 ± 2 26 ± 6 1 ± 2 SOBREVIDA (días) 8 ± ± ± 13 Porcentaje (%) Control 25 Preventivo Tratado Sobrevida (Días) Tumores desarrollados en ratones nude. Izquierda: Adenocarcinoma semidiferenciado con estructuras ductales bien definidas (H.E. 1x). Derecha: expresión de cfos obtenida por inmunohistoquímica en tumor tratado con. Detección por inmunohistoquímica de PCNA. (PCNA 1x): Izquierda: Tumor control con alto número de células intensamente positivas; Centro: Tumor de ratón tratado preventivamente; Derecha: Tumor de ratón tratado con mostrando muy bajo número de células positivas Ensayo de fragmentación de ADN. Células PANC-1 fueron incubadas en ausencia o presencia de durante 12, 24, 48 y 96 hs. El ADN fue extraído con isopropanol-nacl y sometido a electroforesis en un gel de agarosa 1.8%. Los fragmentos internucleosómicos de 2 pb característicos de la apoptosis no se observaron ni en el control ni en las células tratadas. Calles 1 y 2: timocitos de rata tratados con 1 µm de dexametasona por 2 y 6 hs. Control positivo. Calles 3, 4 y 5: células PANC-1 incubadas por 12 hs. Control, 12 hs y 24 hs, respectivamente. Calle 7: Marcadores de peso molecular de ADN (15-1 pb)
5 POSTER P163 - UICC OSLO 22 5 Citometría de flujo. Las células PANC-1 fueron incubadas por 24 hs en ausencia ( ) o en presencia de ( ). El contenido de ADN está presentado como fluorescencia relativa. El pico subdiploide característico de las células apoptóticas (habitualmente visto en la zona M1) es despreciable en las células control y en las tratadas mostrando un porcentaje menor al 2% en ambas condiciones. Similares resultados se obtuvieron cuando las células fueron incubadas durante 48 y 96 hs. CONCLUSIONES Como hemos observado previamente en tumores experimentales el tratamiento con produce una significativa inhibición (6%) de la proliferación in vitro de las células PANC-1. Concordantemente, el tratamiento de ratones nude portadores de tumores indica un efecto in vivo que involucra un significativo aumento en la sobrevida (p<.1 logrank test) y un mayor período de latencia en el grupo preventivo (p<.1, Newman Keuls) comparado con el grupo control. La expresión de PCNA está marcadamente reducida en tumores tratados, mientras que el resultado de la expresión de c-fos indica que probablemente esté desregulado en ésta línea celular. Si bien los mecanismos moleculares involucrados en el efecto de aun deben ser detalladamente investigados, los presentes resultados indican que se ejerce un efecto sobre la proliferación celular que no involucra la inducción de la apoptosis in vitro. El análisis del ciclo celular y del tiempo de duplicación muestran que la acción de probablemente produzca un incremento inicial de la proliferación; este efecto es coincidente con el aumento de la sensibilidad a drogas quimioterapéuticas y radiación ionizante observado in vitro en células transformadas tratadas con. Los resultados aquí presentados concuerdan con el marcado aumento de la sobrevida observado en pacientes con cáncer de páncreas avanzado tratados con esta combinación terapéutica.
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