Introducción. Visión General de la Técnica LECTURA ADICIONAL PARA TRABAJO PRÁCTICO HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS

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1 LECTURA ADICIONAL PARA TRABAJO PRÁCTICO HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS Introducción La reacción de hibridación ARN-ADN fue descubierta por Hall & Spiegelmann (1961) poco tiempo después del hallazgo de la reacción ADN-ADN por Mamur & Lane (1960). Las reacciones de hibridación presentan una gran sensibilidad de detección (< 1pg de secuencia complementaria) e involucra el empleo de equipamiento simple y barato, permitiendo el procesamiento simultáneo de muchas muestras. Su aplicación ha revolucionado nuestra comprensión sobre estructura, función y evolución de los genes, ha demostrado ser de gran utilidad práctica en la determinación de portadores de enfermedades hereditarias, detención de agentes patógenos, determinación de paternidad y en criminalística. Cuando las técnicas de hibridación de ácidos nucleicos comenzaron a aplicarse prácticamente todos los estudios se realizaban con procariotas, esto garantizaba que fueran generalmente alcanzadas las concentraciones necesarias de secuencias específicas, para asegurar que las reacciones prosiguieran satisfactoriamente hasta el punto final. Cuando fue iniciado el estudio de los genes eucarióticos las concentraciones de secuencias específicas de interés pasaron a ser limitantes por estar diluidas en el genoma. Esto resultó en que muchos de los datos obtenidos hacían referencia solamente a secuencias repetitivas de ADN (para las cuales es más difícil conseguir concentraciones adecuadas). Consecuentemente, las conclusiones se tornan totalmente inválidas. Visión General de la Técnica Generalmente lo que se pretende verificar es si una determinada muestra de ADN presenta homología con una sonda, ésta puede ser ARN u otro ADN. La muestra en general está presa en una membrana (nitrocelulosa, nylon o papel de filtro). Para realizar una hibridación son necesarios los siguientes pasos: a) Pre-Hibridación. b) Hibridación. c) Lavado. Tradicionalmente la cuantificación de una hibridación está basada en estudios de renaturalización, los que pueden seguirse por cualquiera de los siguientes métodos: Cátedra Genética Molecular Trabajos Prácticos 1

2 MÉTODO ADN NATIVO ADN DESNATURALIZADO Absorbancia a 260nm 1,0 1,36 Fluorescencia Alta Baja Densidad en CsCl Baja Alta Viscosidad Alta Baja Sensibilidad a S1 Resistente Sensible Temperatura de Fusión (Tm). Es la temperatura que corresponde a una situación en que la mitad de las moléculas de una preparación se encuentran en estado nativo y la otra mitad desnaturalizadas. Factores que influyen en al Tm a) Contenido de GC. Cuanto mayor es el contenido de GC de una preparación de ADN mayor es su Tm. Existe un aumento neto de 0,41ºC en la Tm por cada 1% de CG de la secuencia. La determinación del valor de Tm de una preparación es fácil de calcular sabiendo el contenido de CG. Cuando una reacción es realizada en SSC (0,15 M NACI + 0,015 NaCOO, ph 7) se puede estimar que: Tm = 69,5 + (0,41. % CG) b) Concentración de cationes. Una reacción de renaturalización ocurre entre dos cadenas cargadas negativamente, en virtud de la disociación de dos grupos OH de los radicales fosfatos. Consecuentemente es de esperar que la reacción sea fuertemente influenciada por la concentración de cationes del medio en que se procesa. Para el Na el efecto en la Tm puede estimarse como: Tm = 81,5 + [16,6. log (Na) + ] + 0,41 (%CG) -500/n Donde n es el tamaño de la sonda. Cátedra Genética Molecular Trabajos Prácticos 2

3 c)"mismatching". Cuando dos secuencias de ADN que no son perfectamente complementarias reaccionan y forman un ADN dúplex se debe tener en cuenta que por cada un 1% de base no apareadas distribuidas a lo largo de las secuencias existe disminución de Tm correspondiente a 0,72ºC. d) Efecto de la formamida. La formamida conduce a una disminución de la Tm. Un incremento de un 1% (v/v) en la concentración de formamida produce una disminución en el Tm de 0,5ºC. Para poli da=dt y de 0,75ºC para un poli dc=dg, mientras que para un ADN con un contenido medio de CG la disminución de Tm es de 0,63ºC por cada aumento del 1% (v/v) de formamida. Cinética de la reacción de renaturalización Si la concentración de ADN de hebra simple en solución fuera C, podemos representar la reacción de renaturalización como: ADN + ADN ADN. ADN C + C C0 - C Considerando que la reacción de renaturalización se da gracias al encuentro inicial entre dos regiones complementarias, decimos que se produce una nucleación. Si la reacción es conducida a una Tm -15 ºC será esencialmente irreversible y la velocidad de renaturalización (dc/dt) estará dada por: dc /dt = - k2c 2 Donde t es el tiempo en segundos y k2 es una constante de segundo orden correspondiente a la reacción de renaturalización. Si integramos esta reacción entre los límites de t=0 y un tiempo t cualquiera, entre una concentración inicial C0 y una concentración C existente en el tiempo t, tendremos: C0 C k2 C0t Esta ecuación muestra que la cantidad de renaturalización observada es proporcional al producto de la concentración inicial por el tiempo de la reacción. Si realizamos un gráfico de C/C0 versus C0T (concentración inicial por tiempo) tendremos una curva típica de una reacción de 2 do orden, esto es, su velocidad depende solamente de las especies moleculares existentes en solución. Cátedra Genética Molecular Trabajos Prácticos 3

4 El punto de inflexión de la curva corresponde al 50% de la renaturalización del ADN. En este punto C/C0=1/2, sustituyendo este valor en la ecuación anterior tenemos: 1 C0t1/2 = k2 Por lo tanto, el C0t1/2 es una constante cuyo valor es característico para cada preparación de ADN. Complejidad Cinética La complejidad de un ADN corresponde al contenido total de sus secuencias no repetidas, medidas en pares de bases. Aplicando esta definición a una secuencia muy grande, pero compuesta solamente de pares A y T, llegamos a la conclusión que la complejidad es de 2. Simplemente una secuencia compuesta de ATC tiene una complejidad de 3. La complejidad de un ADN desprovisto de secuencias repetidas es igual al tamaño del genoma. En el caso de organismos que contienen secuencias representadas más de una vez en el genoma la complejidad es igual a la suma de las complejidades de las diferentes fracciones. La mejor manera de definir la complejidad de un ADN consistiría en determinar su secuencia de bases, pero esto no es práctico. Una idea aproximada de la complejidad de un ADN puede ser obtenida mediante la complejidad cinética. Cátedra Genética Molecular Trabajos Prácticos 4

5 Una de las observaciones más importantes realizadas por Britten (1974) y por Wetmur & Davidson (1968) es que los valores de las constantes de renaturalización de preparaciones de ADN (en condiciones idénticas de temperatura y fuerza iónica) son inversamente proporcionales a sus complejidades cinéticas, dicho en ecuación: K2i = K/N i Donde K es una constante de proporcionalidad que en condiciones normales (NaCI 0,18M) tiene un valor de 10 6, N i es la complejidad cinética de cualquier ADN y K2i es la constante de renaturalización. Hibridación en medio líquido y en membranas Una reacción de hibridación, permite la realización de ensayos en poblaciones de ARN o ADN cuyas especificidades están basadas en los mismos principios del mecanismo básico de la herencia; esto es; las fuerzas que mantienen el apareamiento A=T y C=G. Para que estas reacciones se manifiesten al máximo de especificidad deben ser conducidas en condiciones adecuadas de reactivos, temperatura y fuerza iónica. ADN-ARN En las reacciones de hibridación normalmente están presentes dos hebras de ADN contra las cuales se hibridará la sonda. ADN + ARN C + R ADN. ARN H Donde H es la concentración de moléculas híbridas formadas. Considerando inicialmente un caso especial, aquel en que la reacción es conducida en exceso de ARN, las velocidades de desaparición de hebras simples de ADN está dada por: dc/ dt = - k2 RC Como la reacción es llevada a cabo en exceso de ARN, su concentración casi no será alterada, por lo tanto tenemos que: Cátedra Genética Molecular Trabajos Prácticos 5

6 C/C0 = e - k 2 R 0 t Si ignoramos la reacción de renaturalización y consideramos solamente la de hibridación, la velocidad de formación del híbrido estará dada por: dh/dt = k2 RC Dado que C = C0 -H y R = R0 se puede arreglar la ecuación: 1/(C0-R0) In (C0 - H)/ (R0 -H) = k2t + Constante Esta constante de integración puede ser calculada si consideramos que para t=0 tenemos H=O Constante = 1/(C0 -R0) In C0 / R0 Sustituyendo este valor de la constante en la ecuación anterior tenemos que: H = C0R0 [1- e (C 0-R 0 ) k 2 t ]/ R0 - C0 e (C 0-R 0 ) k 2 t Esto nos brinda una idea muy aproximada de la cantidad de híbrido que obtendríamos. Reacciones en condiciones de exceso de ADN Se entiende por exceso de ADN cuando la razón ADN/ARN es superior a 20, en estas condiciones tenemos que R0 puede despreciarse, por lo tanto la ecuación para el cálculo de la cantidad de híbrido formado sería: Cátedra Genética Molecular Trabajos Prácticos 6

7 H = R0 [ 1 - e - k 2C 0 t ] Para valores altos C0t, el valor de e - k 2 c 0 t tiende a 0 por lo tanto la ecuación se reduce a: H = R0 Cuando la reacción alcanza su punto medio tenemos que H = R0/2, por lo tanto: t1/2 = In2/k2C0 y k2 = In2/C0t1/2 El punto medio de la reacción depende exclusivamente de la concentración inicial de ADN cuya hibridación está siendo estudiada. Hibridación en condiciones de exceso de ARN En estas condiciones el término C0e (C 0 - R 0 ) k 2 t tiende a cero, por lo que la ecuación queda: H = C0 (1 - e R ok 2 t ) Trabajando de manera similar a lo realizado con las ecuaciones en exceso de ADN tenemos que: H = C0 t1/2 = In2/k2R0 y k2 = In2/R0t1/2 Por lo tanto, el punto medio de la reacción depende exclusivamente de la concentración de ARN. Así tenemos que en condiciones de exceso de ARN el ADN complementario hibridará, consecuentemente en estas condiciones es posible titular la cantidad de ADN específico existente. Cátedra Genética Molecular Trabajos Prácticos 7

8 Condiciones óptimas de hibridación Conseguir condiciones óptimas de hibridación significa variar temperatura y tiempo de reacción, concentración de reactivos, concentración salina y sustancias como la formamida. La temperatura de hibridación (Th) es uno de los parámetros más importantes para la obtención de una cinética óptima. Como consideraciones generales podemos decir que: a) La Th de una hibridación ADN-ADN se encuentra aproximadamente entre 20 y 25 ºC menos que la Tm b) La Th de una hibridación ARN-ADN se encuentra aproximadamente entre 15 ºC menos que la Tm c) La Th de una hibridación ARN - ARN se encuentra aproximadamente entre 15 ºC menos que la Tm Una manera empírica de calcular valores de Tm cuando la hibridación se realiza en soluciones salinas sería: Tm = 81,5 + 16,6 log(m) + 0,41 (% GC) - 0,63 (% Formamida) - 500/n Donde n es el tamaño de la sonda, M es la concentración molar del catión Na +. Cálculo del tiempo de la reacción Para poder calcular el tiempo de la hibridación es necesario conocer el Cot del ADN que estamos estudiando. Para un punto final con un rendimiento del 91% tenemos que: C/C0 = 10 C0t1/2 Por lo tanto el tiempo que debe transcurrir será igual a: t = C0t1/2 / C0 Cátedra Genética Molecular Trabajos Prácticos 8