Tecnologías basadas en la PCR

Transcripción

1 Tecnologías de marcadores moleculares para estudios de diversidad genética de plantas: Módulo de aprendizaje Tecnologías basadas en el ADN Tecnologías basadas en la PCR PCR con cebadores arbitrarios (RAPD, DAF, AP-PCR) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 1

2 Contenido PCR con cebadores arbitrarios Tecnología RAPD, paso a paso: Aislamiento del ADN Reacción en cadena de la polimerasa Detección del producto de RAPD Diagrama de resumen Equipo Interpretación de los patrones de bandas RAPD Ventajas y desventajas de los RAPD Ejemplos de aplicaciones Festuca pratensis Pimiento Rosa Diferencias: DAF y las tecnologías de la AP-PCR Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 2

3 PCR con cebadores arbitrarios MAAP (caracterización con amplicones múltiples arbitrarios) es la sigla propuesta para incluir las tres tecnologías principales que corresponden a esta categoría: Polimorfismo de ADN amplificado al azar (RAPD) Amplificación de la huella de ADN (DAF) Reacción en cadena de la polimerasa iniciada al azar (AP-PCR) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 3 Tres técnicas principales se inscriben dentro de la categoría de marcadores basados en la PCR usando cebadores arbitrarios: RAPD, DAF y AP-PCR. MAAP es la sigla propuesta por Caetano-Anollés et al. (1992), aunque no suele usarse, para incluir estas técnicas estrechamente relacionadas. En este submódulo se prestará atención especial a los RAPD y al final se hará una comparación entre los RAPD y las técnicas DAF y AP- PCR. Referencia Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff DNA fingerprinting: MAAPing out a RAPD redefinition? Bio/Technology 10 (9):937.

4 Tecnología RAPD, paso a paso Características principales: Emplea un cebador aleatorio corto (generalmente, de 10 bases) Amplifica trozos anónimos de ADN Etapas de laboratorio: Aislamiento del ADN PCR con un cebador Separación de los fragmentos de ADN mediante electroforesis Visualización de los fragmentos de ADN con bromuro de etidio Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 4 La técnica para detectar polimorfismo en el ADN amplificado al azar (RAPD) es un método basado en la PCR, en el que se emplea un cebador corto (generalmente, de 10 bases) para amplificar porciones anónimas de ADN. Con esta técnica no se busca ningún fragmento de ADN específico, ya que el cebador se adherirá al ADN patrón en secuencias complementarias de ubicación desconocida. En consecuencia, no se conocerá la naturaleza de los productos obtenidos. Los fragmentos de ADN así generados se separan y se detectan mediante electroforesis.

5 Aislamiento del ADN Se puede usar ADN total, cloroplástico o mitocondrial Cantidades diminutas de ADN son suficientes El ADN debe estar limpio y su peso molecular debe ser elevado Si no es posible obtener un ADN de calidad mínima, será difícil garantizar la reproducibilidad de los resultados Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 5

6 Reacción en cadena de la polimerasa Componentes de la PCR Los cebadores (10 bases de longitud) se consiguen de diferentes proveedores comerciales Es habitual la adición de MgCl 2 Los ciclos de hibridación (acoplamiento de los cebadores al ADN patrón) se realizan a temperaturas bajas (cerca de 40 C) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 6 Los componentes que necesita la PCR se tratan en el submódulo Nociones básicas de la PCR. Aquí sólo se usa un cebador corto (generalmente de 10 pb de longitud). Los cebadores con estas características están comercialmente disponibles de marcas diferentes. A menudo se agrega una concentración de MgCl 2 para promover la amplificación de más bandas durante la reacción. Sin embargo, se debe tener cuidado de determinar la concentración apropiada para cada caso, lo que evitará la aparición de productos no específicos. Entre las condiciones de la PCR está, generalmente, un ciclo de hibridación a baja temperatura (aproximadamente 40 C) que estimulará la hibridación entre el cebador y el ADN y dará lugar a una cantidad suficiente de productos. Además, se debe impedir la aparición de productos no específicos, y esto puede hacerse determinando la temperatura apropiada en que no aparecerán bandas fantasma.

7 Detección de productos RAPD Electroforesis de geles de agarosa o de acrilamida y visualización con bromuro de etidio Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 7 Los RAPD pueden detectarse al migrar los productos de la PCR mediante electroforesis en un gel de agarosa o de acrilamida. En ambos casos, el gel se tiñe con bromuro de etidio. La diferencia entre hacer migrar los productos del RAPD en acrilamida o en agarosa está solamente en el grado de resolución de las bandas. En la mayoría de los casos, la electroforesis en geles de agarosa proporciona suficiente resolución.

8 Diagrama de resumen A D Cebador Banda amplificada E B G C F Molécula de ADN Adaptado de Griffiths y col Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 8 E C A D B F Gel

9 Equipo Recursos: Agua destilada o desionizada (o ambas) Reactivos Equipo: Refrigerador y congelador Campana extractora de flujo laminar Centrífuga Termociclador Fuente de energía eléctrica Hornillo o microondas Medidor de ph Balanza Unidades de electroforesis Transiluminador de luz ultravioleta Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 9

10 Interpretación de patrones de bandas RAPD (1) El polimorfismo del ADN en un grupo de individuos puede deberse a: Ensamblaje frustrado en el sitio del cebador Aparición de un nuevo sitio de reconocimiento del cebador Longitud de la región amplificada entre los sitios de reconocimiento del cebador Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 10

11 Interpretación de patrones de bandas RAPD (2) A causa de la naturaleza de los marcadores RAPD, sólo puede evaluarse la presencia o la ausencia de una banda. Los criterios para seleccionar bandas que califican son: Reproducibilidad: es necesario obtener los mismos resultados en experimentos repetidos Espesor (de la banda) Tamaño Observación de la segregación esperada en una población segregante Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 11

12 Interpretación de patrones de bandas RAPD: Ejemplo de un gel RAPD de mala calidad Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 12 Esta foto es una imagen de un gel de RAPD de mala calidad. Las bandas son borrosas. Las de la parte superior tienen una sombra que comienza en el pocillo donde se cargó el producto de la PCR y muchas se observan con dificultad. El fondo difuso complica la observación: en qué casos hay una banda o hay dos lado a lado? Algunas bandas son claras, sin duda, y podrían tenerse en cuenta, pero otras muchas son dudosas y su interpretación sería sumamente arriesgada. Esas dificultades hacen dudar de la confianza que merecen los datos obtenidos.

13 Interpretación de patrones de bandas RAPD: Ejemplo de un gel RAPD de buena calidad Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 13 Esta foto es una imagen de un gel de RAPD de buena calidad. Tanto la presencia como la ausencia de la mayoría de las bandas son datos claros y el fondo es transparente. El investigador no tendría dudas al seleccionar las bandas y tomar datos de este gel. En consecuencia, la interpretación de los resultados sería muy fiable.

14 Ventajas de los RAPDs Número alto de fragmentos Técnica sencilla Los cebadores arbitrarios se adquieren fácilmente, y no requieren de información inicial de tipo genético o genómico Se requieren cantidades diminutas del ADN patrón Los costos unitarios por ensayo son bajos Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 14 Algunos comentarios: Normalmente se amplifican muchos fragmentos diferentes (que corresponden a múltiples loci dispersos por todo el genoma) empleando un solo cebador. Por consiguiente, la técnica es rápida para detectar polimorfismos. Aunque la mayoría de los cebadores comerciales dan lugar a varios fragmentos, algunos cebadores pueden fallar en la amplificación de fragmentos de algunos materiales. La técnica es sencilla. El análisis de RAPD no requiere la pericia especial con que se maneja la hibridación del ADN a membranas u otras actividades más especializadas.

15 Desventajas de los RAPDs De herencia dominante Falta de conocimiento previo de la identidad de los productos de la amplificación Problemas de reproducibilidad Problemas por co-migración Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 15 Los marcadores de RAPD son dominantes. La amplificación ocurre en un locus o no ocurre, lo que exige considerar las bandas partiendo de su presencia o de ausencia. Esto significa que los homocigotos y los heterocigotos no pueden distinguirse. Además, la ausencia de una banda debida a la falta de una secuencia determinada no puede distinguirse de la ausencia debida a la falta de amplificación por otras razones (por ejemplo, porque el ADN era de calidad deficiente), lo que contribuye a la ambigüedad en la interpretación de los resultados. No se sabe nada acerca de la identidad de los productos de amplificación a menos que los estudios estén apoyados en análisis de herencia. Los problemas de reproducibilidad provienen de que la tecnología de RAPD es sensible a los cambios en la calidad del ADN, en los componentes de la PCR y en las condiciones de la PCR, todo lo cual ocasiona cambios en los fragmentos amplificados. Se pueden obtener resultados reproducibles si se tiene cuidado de estandarizar las condiciones de los experimentos (Munthali y col., 1992; Lowe y col., 1996). Los problemas de co-migración motivan preguntas como ésta: Corresponden las bandas de igual tamaño al mismo fragmento de ADN? La presencia de una banda de idéntico peso molecular en diferentes individuos no es, por sí misma, una prueba de que los individuos comparten el mismo fragmento de ADN (fragmento `homólogo`). Una banda detectada en un gel como banda sola puede en realidad comprender diferentes productos de amplificación. Esto ocurre porque el tipo de electroforesis usado, aunque es capaz de separar el ADN cuantitativamente (es decir, según el tamaño), no puede separar los fragmentos de igual tamaño cualitativamente (es decir, según la secuencia de las bases). Referencias Lowe, A.J., O. Hanotte y L. Guarino Standardization of molecular genetic techniques for the characterization of germplasm collections: the case of random amplified polymorphic DNA (RAPD). Plant Genet. Resour. Newsl. 107: Munthali, M., B.V. Ford-Lloyd y H.J. Newbury The random amplification of polymorphic DNA for fingerprinting plants. PCR Methods Appl. 1(4):

16 Ejemplos de aplicaciones Diversidad genética Caracterización de germoplasma Estructura genética de poblaciones Domesticación Detección de variación somaclonal Identificación de cultivares Pureza híbrida Cartografía genética Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 16 Las referencias en color púrpura se explican detalladamente en las siguientes diapositivas. Cattan-Toupance, I., Y. Michalakis y C. Neema Genetic structure of wild bean populations in their South Andean centre of origin. Theor. Appl. Genet. 96: Cristofani, M., M.A. Machado y D. Grattapaglia Genetic linkage maps of Citrus sunki Hort. ex. Tan. and Poncirus trifoliata (L.) Raf. and mapping of citrus resistance gene. Euphytica 109(1): Hashmi, G., R. Huettel, R. Meyer, L. Krusberg y F. Hammerschlag RAPD analysis of somaclonal variants derived from embryo callus cultures of peach. Plant Cell Rep 16(9): Kölliker, R., F.J. Stadelmann, B. Breidy y J. Nösberger Fertilization and defoliation frequency affect genetic diversity of Festuca pratensis Huds. In permanent grasslands. Mol. Ecol. 7: Martelli, G., F. Sunseri, I. Greco, M.R. Sabina, P. Porreca y A. Levi Strawberry cultivars genetic relationship using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. Adv. Hortic. Sci. 13(3): Martin, M., F. Piola, D. Chessel, M. Jay y P. Heizmann The domestication process of the Modern Rose: genetic structure and allelic composition of the rose complex. Theor. Appl. Genet. 102: Morden, C.W. y W. Loeffler Fragmentation and genetic differentiation among subpopulations of the endangered Hawaiian mint Haplostachys haplostachya (Lamiaceae). Mol. Ecol. 8: Nebauer, S.G., L. del Castillo-Agudo y J. Segura RAPD variation within and among natural populations of outcrossing willow-leaved foxglove (Digitalis obscura L.). Theor. Appl. Genet. 98: Rodríguez, J.M., T. Berke, L. Engle y J. Nienhuis Variation among and within Capsicum species revealed by RAPD markers. Theor. Appl. Genet. 99: Rom, M., M. Bar, A. Rom, M. Pilowsky y D. Gidoni Purity control of F 1 -hybrid tomato cultivars by RAPD markers. Plant Breed. 114(2):

17 Ejemplo: Festuca pratensis Título: Fertilization and defoliation frequency affect genetic diversity of Festuca pratensis Huds. in permanent grasslands. Mol. Ecol : Objetivo: Evaluar la variabilidad genética de Festuca pratensis y determinar si la frecuencia de fertilización y de defoliación afectan la variabilidad genética dentro de las poblaciones naturales Materiales y métodos: Se estudiaron 6 poblaciones naturales y 3 cultivares de Festuca pratensis mediante 69 marcadores RAPD (13 cebadores) y 7 caracteres agronómicos Se tomaron muestras de las poblaciones naturales de dos experimentos de largo plazo no relacionados entre sí, en los que se habían aplicado tratamientos durante períodos que iban de 11 a 38 años Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 17 (continúa en la siguiente)

18 Ejemplo: Festuca pratensis (continuación) Resultados: El análisis factorial de los caracteres agronómicos no permitió separar los cultivares de las otras poblaciones El análisis de agrupamiento con los datos de RAPD señaló una clara distinción entre cultivares y poblaciones naturales La variabilidad genética dentro de cultivares fue inferior que dentro de poblaciones naturales El análisis de la varianza molecular (AMOVA) mostró un efecto significativo del manejo sobre la variación genética Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 18 (continúa en la siguiente)

19 Ejemplo: Festuca pratensis (continuación) Discusión: Existe variación genética significativa dentro de los cultivares y de las poblaciones naturales de Festuca pratensis. Sin embargo, la fertilización y alta frecuencia de corte pueden reducirla Conclusiones: Las poblaciones de Festuca pratensis no fertilizadas y raramente cortadas deben conservarse como un acervo genético. Se necesitan estudios adicionales sobre otras especies para aprender más acerca de la forma en que los sistemas de manejo afectan la diversidad de las comunidades vegetales y la arquitectura genética de la especie Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 19

20 Ejemplo: Pimiento Título: Variation among and within Capsicum species revealed by RAPD markers. Theor. Appl. Genet : Objetivo: Caracterizar el germoplasma de especies de Capsicum Materiales y métodos: Se caracterizaron 134 entradas de seis especies de Capsicum, conservadas en el banco de germoplasma del Asian Vegetable Research and Development Center (AVRDC), empleando 110 marcadores RAPD (25 cebadores) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 20 (continúa en la siguiente)

21 Ejemplo: Pimiento (continuación) Resultados y discusión: Se documentó la existencia de 10 pares de entradas que podían estar duplicadas Se identificaron RAPD de diagnóstico que se emplearon para mejorar la identificación taxonómica. También podrían usarse para verificar la hibridación natural y artificial Tres entradas de Capsicum que estaban mal clasificadas según sus caracteres morfológicos, fueron re-identificadas con los RAPD de diagnóstico Se asignaron tres entradas, no clasificadas antes, a una especie partiendo de los RAPD de diagnóstico Las entradas de Capsicum annuum del banco no fueron diferentes de las líneas del programa de fitomejoramiento respecto a la variación o diversidad indicada por los marcadores RAPD Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 21 (continúa en la siguiente)

22 Ejemplo: Pimiento (continuación) Conclusiones: El programa de mejoramiento de pimiento del AVRDC trabaja, al parecer, con una diversidad que es representativa de su colección en el banco de germoplasma. Los marcadores moleculares pueden ser útiles para racionalizar el manejo de una colección ex situ (por ejemplo, identifican duplicados o errores taxonómicos) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 22

23 Ejemplo: Rosa Título: The domestication process of the Modern Rose: genetic structure and allelic composition of the rose complex. Theor. Appl. Genet : Objetivo: Evaluar la variabilidad genética existente entre variedades cultivadas de rosa e investigar la historia de su fitomejoramiento Materiales y métodos: Se seleccionaron, de 13 grupos horticulturales, 100 variedades antiguas de rosa cultivada por el modo en que definieron las etapas sucesivas de su domesticación. Se estudiaron mediante AP-PCR con cinco cebadores largos (de 20 bp) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 23 (continúa en la siguiente)

24 Ejemplo: Rosa (continuación) Resultados y discusión: Se produjeron 58 fragmentos polimórficos de ADN, de los cuales 55 fueron informativos y discriminatorios, y permitieron diferenciar casi todos los 100 cultivares Un dendrograma mostró las relaciones existentes entre las rosas de fundación chinas y europeas, los grupos híbridos de la primera y segunda generaciones, y los híbridos más modernos producidos durante la domesticación El análisis de componentes principales demostró la existencia de un gradiente continuo en la proporción entre alelos europeos y alelos chinos, y una considerable reducción de la variabilidad genética en el curso de la domesticación Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 24 (continúa en la siguiente)

25 Ejemplo: Rosa (continuación) Conclusiones: El efecto de la selección de un rango limitado de caracteres morfológicos resultó en la retención de un bajo número de alelos durante la domesticación de la rosa. La rosa tiene mucha más variación genética de la que se ha usado hasta ahora. Debe estudiarse la posibilidad de seleccionar diversas variantes con nuevos y valiosos caracteres estéticos para desarrollar más variedades Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 25

26 Diferencias entre las tecnologías DAF y RAPD Respecto a la DAF: Las concentraciones de cebador son más altas Se usan cebadores más cortos (de 5 a 8 nucleótidos) Un ciclo de dos temperaturas en lugar de un ciclo de 3 temperaturas (usado en RAPD) Obtención de combinaciones de bandas sumamente complejas Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 26 Referencias Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1991a. DNA amplification fingerprinting: a strategy for genome analysis. Plant Mol. Biol. Rep. 9(4): Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1991b. DNA amplification using very short arbitrary oligonucleotide primers. Bio/Technology 9:

27 Diferencias entre las tecnologías AP-PCR y RAPD Respecto a AP-PCR: La amplificación se realiza en tres partes, cada una con sus propios requisitos y concentración de elementos constitutivos Se emplean concentraciones altas del cebador en los primeros ciclos de la PCR Se eligen arbitrariamente cebadores de longitud variable y diseñados, a veces, para otros fines (por ejemplo, el cebador universal de análisis de secuencias M13) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 27 Referencia Welsh, J. y M. McClelland Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res. 18(24):

28 En resumen La tecnología RAPD se basa en una PCR sencilla con un solo cebador arbitrario y corto La técnica RAPD produce fácilmente un número notable de bandas, pero sus marcadores son dominantes y son frecuentes los problemas de reproducibilidad DAF y AP-PCR son tecnologías alternas respecto a los RAPD, pero más complejas Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 28

29 Hasta el momento usted debería saber Las características principales del procedimiento de RAPD Las causas de los polimorfismos de la molécula de ADN que pueden detectarse con RAPD Los criterios para la selección de bandas RAPD para análisis de diversidad genética Las ventajas y las desventajas de la tecnología RAPD Las diferencias principales de la DAF y de la AP-PCR con respecto a la tecnología de RAPD Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 29

30 Referencias bá sicas Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1991a. DNA amplification fingerprinting: a strategy for genome analysis. Plant Mol. Biol. Rep. 9(4): Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff. 1991b. DNA amplification using very short arbitrary oligonucleotide primers. Bio/Technology 9: Caetano-Anollés, G., B.J. Bassam y P.M. Gresshoff DNA fingerprinting: MAAPing out a RAPD redefinition? Bio/Technology 10(9):937. Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin y W.M. Gelbart An introduction to genetic analysis (6th edn.). W.H. Freeman, NY, E.U. Lowe, A.J., O. Hanotte y L. Guarino Standardization of molecular genetic techniques for the characterization of germplasm collections: the case of random amplified polymorphic DNA (RAPD). Plant Genet. Resour. Newsl. 107: Munthali, M., B.V. Ford-Lloyd y H.J. Newbury The random amplification of polymorphic DNA for fingerprinting plants. PCR Methods Appl. 1(4): Welsh, J. y M. McClelland Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res. 18(24): Williams, J.G.K., A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski y V. Tingey DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18(22):

31 A continuación Tecnologías basadas en el ADN Tecnologías basadas en la PCR Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP) Tecnologías basadas en el ADN Tecnologías basadas en la PCR Sitios de secuencia etiquetada (STS) Últimas estrategias Tecnologías complementarias Consideraciones finales Glosario Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 Cebadores arbitrarios 30