Pruebas bioquímicas y moleculares para la identificación y distinción varietal

Transcripción

1 Pruebas bioquímicas y moleculares para la identificación y distinción varietal Amalio Santacruz Varela 31 de agosto de 2011

2 Puntos a abordar Introducción Importancia de los marcadores bioquímicos y moleculares Concepto de marcadores bioquímicos y moleculares Principios en que se basan las técnicas de marcadores Ejemplos de marcadores usuales Bioquímicos De ADN Qué se ha concretado en la UPOV? 1

3 INTRODUCCIÓN Niveles en la identificación varietal En el fenotipo: Es la combinación de los caracteres individuales que resultan de u genotipo y de su interacción con el ambiente. Se concentra en rasgos morfológicos o fisiológicos que definen la forma y apariencia de un grupo de individuos. En el genotipo: Es la constitución genética particular de un organismo. Se realiza al nivel de la molécula de ADN (o sus productos directos) que es la responsable de la transmisión de la información genética. 16

4 Identificación varietal a nivel de fenotipo Medición generalmente sencilla No requiere equipo sofisticado o costoso Constituyen mediciones directas Requiere un conocimiento práctico del cultivo Está sujeta a influencias ambientales El número de caracteres confiables es limitado 17

5 Marcadores moleculares Dogma central de la Biología Molecular La información fluye del ADN al ARN por vía del proceso llamado transcripción, y luego a la proteína por el proceso de traducción. 2

6 Marcadores bioquímicos Para superar las limitaciones de los marcadores morfológicos, se han desarrollado otros tipos de marcadores, unos de ellos, a nivel de proteínas, conocidos también como marcadores bioquímicos. Los marcadores bioquímicos pueden ser proteínas de almacenamiento de la semilla e isoenzimas. Se obtienen mediante electroforesis, aprovechando las propiedades migratorias de las proteínas, y se detectan mediante tinciones histoquímicas específicas de las proteínas que se quieren analizar. 3

7 Proteínas de reserva Maíz: Prolaminas (zeinas), albúminas, globulinas, glutelinas Trigo: Prolaminas (gliadinas), glutelinas (gluteninas), albúminas, globulinas Cebada: Hordeínas Leguminosas: Globulinas (Leguminas, vicilinas) 4

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9 Isoenzimas Múltiples formas de la misma enzima Metodología a) Macerar el tejido y extraer las enzimas 6

10 Isoenzimas Metodología b) Separar las enzimas por electroforesis 7

11 Isoenzimas Metodología c) Localizar las enzimas por tinción histoquímica 8

12 d) Analizar los patrones de bandas Malato deshidrogenasa A B C 9

13 Glutamato oxaloacetato transaminasa 9

14 Marcadores moleculares Son secuencias detectables de ADN cuya herencia puede ser monitoreada Varios eventos (mutaciones puntuales, inserciones, deleciones, duplicaciones, rearreglos) pueden dar lugar a variantes en la secuencia del ADN. A tales variantes se les denomina polimorfismos, que se traducen en diferencias en el genotipo (como lo evidencían los diferentes perfiles de bandas); y tal vez repercuta en el fenotipo 10

15 Propiedades deseables de los marcadores moleculares Altamente polimórficos Que presenten codominancia Que se presenten en todo el genoma Fáciles, rápidos y baratos para la detección Reproducibles dentro y entre laboratorios Propios para automatización 11

16 Marcadores moleculares Tipos de marcadores moleculares más comunes: RFLPs RAPDs Repeticiones en serie (Minisatélites, microsatélites) AFLPs etc. 12

17 SSRs (Secuencias simples repetidas o Microsatélites) Es una técnica que usa iniciadores ( primers ) para sitios específicos (aquellos donde se encuentran las secuencias repetidas) y amplifica fragmentos de ADN plenamente identificados. Etapas de la metodología en laboratorio: Extracción y cuantificación de ADN Reacción de PCR con los iniciadores específicos Separación de los fragmentos de ADN por electroforesis Visualización de los fragmentos de ADN usando bromuro de etidio, nitrato de plata o mediante etiquetas fluorescentes 13

18 Análisis de microsatélites Extracción de ADN 14

19 Cuantificación de ADN Relación de absorbancia 260/280 nm entre 1.0 y

20 Amplificación de los microsatélites Desnaturalización inicial de 4 minutos a 95 C, 25 ciclos de 1 minuto a 95 C (desnaturalización), 2 minutos a 55 C (alineación) 2 minutos a 72 C (extensión) 10 minutos de extensión final a 72 C. 18

21 Electroforesis 19

22 Automatización del proceso 20

23 Cuadro 1. Iniciadores a utilizar para la amplificación de Secuencias Simples Repetidas en poblaciones de razas mexicanas de maíz Grupo Locus BIN # Unidad Repetitiva Tamaño de fragmento (bp) Iniciador adelante// Iniciador en reversa phi GTGC ROX-ATATGCATTGCCTGGAACTGGAAGGA// AATTCAAACACGCCTCCCGAGTGT phi AGG FAM-GCGAAAGCGAACGACAACAATCTT// ACATCGTCAGATTATATTGCAGACCA 1 phi ATAC HEX-GCTCCGTGTTTCGCCTGAA// ACCATCACCTGAATCCATCACA phi TTTG HEX-GCAACGTACCGTACCTTTCCGA// ACGCTGCATTCAATTACCGGGAAG phi CCT FAM-ATCGAAATGCAGGCGATGGTTCTC// ATCGAGATGTTCTACGCCCTGAAGT phi ATGT ROX-CTGCCTCTCAGATTCAGAGATTGAC// AACCCAACGTACTCCGGCAG phi CAAA FAM-GTGCATGATTAATTTCTCCAGCCTT// GACAGCGCGCAAATGGATTGAACT phi CTAG ROX-GTGCGTCAGCTTCATCGCCTACAAG// CCATGCATGCTTGCAACAATGGATACA 2 phi CCT HEX-CTCCGCTTCCACTGTTCCA// TGTCCGCTGCTTCTACCCA phi GCGTT FAM-AGCAGAACGGCAAGGGCTACT// TTTGGCACACCACGACGA phi CCT HEX-TAGCGACAGGATGGCCTCTTCT// GGGGAGCACGCCTTCGTTCT phi CCG FAM-AGGAAAATGGAGCCGGTGAACCA// TTGGTCTGGACCAAGCACATACAC phi GCC ROX-ACTTGCTTGCCTGCCGTTAC// CGCACACCACTTCCCAGAA 3 phi ATCC HEX-CGAATTGAAATAGCTGCGAGAACCT// ACAATGAACGGTGGTTATCAACACGC phi AAGC ROX-AACATGCCAGACACATACGGACAG// ATGGCTCTAGCGAAGCGTAGAG 20

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26 Variedades de maíz palomero Morfología SSRs 20

27 Se puede mejorar la congruencia? (Caso maíz) 20

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31 Situación actual Para la mayoría de las especies, las pruebas DHE se basan en características morfológicas, las cuales, son influenciadas por el ambiente y además: Requieren evaluaciones en distintas localidades y un cierto número de repeticiones. Las características deben evaluarse a lo largo de todo el ciclo del cultivo o por más de un ciclo, dependiendo de la especie, lo que conlleva un mayor consumo de tiempo. En este contexto, los exámenes DHE podrían beneficiarse de las bondades y ventajas que les brindarían los marcadores bioquímicos y moleculares. 20

32 Situación actual El uso de marcadores aún no está generalizado, algunos países han implementado su aplicación como complemento de las características morfológicas. Ejemplos: Inglaterra: ha incorporado como criterio de distinción varietal para trigo los perfiles electroforéticos de gliadinas Francia: para la identificación y el registro de líneas de maíz trigo y cebada emplean patrones isoenzimáticos Italia: utilizan el análisis de hordeínas para cebada siguiendo un protocolo de la UPOV. 20

33 Qué se ha concretado en la UPOV? 1. Se prefiere el uso de microsatélites sobre otro tipo de marcadores. 2. Se prevee que en el futuro el tipo preferido de marcadores sean los polimorfismos de nucleótido individual (SNPs), para lo cual es necesario secuenciar el ADN. 3. Se necesita con urgencia armonizar las metodologías de marcadores moleculares para garantizar la calidad de los datos. 4. Se debe poner atención a la definición de un grupo núcleo de marcadores para uso estándar. 20

34 LA VISIÓN DE LA UPOV Uso de marcadores moleculares en el examen DHE 20

35 Técnicas moleculares? 20

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37 Consideraciones legales Conformidad con el Convenio de la UPOV Impacto potencial en el valor de la protección Consideraciones técnicas Fiabilidad y fortaleza del sistema Acceso a la tecnología Armonización de métodos Costo del examen Consecuencias para los obtentores (e.j. costo y tiempo involucrado para nuevos requisitos de uniformidad) 20

38 MODELOS DE APLICACIÓN VISUALIZADOS POR LA UPOV 1. Marcadores moleculares específicos de caracteres EJEMPLO: MARCADOR GENÉTICO ESPECÍFICO PARA LA TOLERANCIA A LOS HERBICIDAS 20

39 1. Una variedad se modifica genéticamente mediante la inserción de un gen para la tolerancia al herbicida X. Las variedades que contienen este gen no se ven afectadas cuando se les aplica X, mientras que las variedades que no tiene este gen mueren sistemáticamente. La tolerancia a la Fórmula X, examinada en ensayos en parcelas pulverizando las parcelas, es un carácter DHE aceptado, y puede utilizarse para establecer la distinción entre variedades. 2. Se propone que, en lugar de asperjar las variedades en las parcelas (debido a la dificultad de organizarlo en los ensayos DHE estándar), se examine el carácter tolerancia al herbicida X realizando un examen para determinar la presencia de un marcador molecular vinculado al gen. Este marcador se encuentra en una parte del gen construido. El marcador puede localizarse en el gen, parcialmente en el gen o fuera del propio gen. 20

40 Premisas a) El examen DHE Que el examen para el marcador tendrá el mismo alcance que el ensayo en parcela, es decir, el mismo número de plantas individuales, durante el mismo número de años y con los mismos criterios para establecer la distinción, la homogeneidad y la estabilidad. b) Fiabilidad de los vínculos Que se controlará el vínculo entre el marcador y el gen a fin de garantizar que el marcador sea un predictor fiable de la tolerancia a la Fórmula X. Este control será necesario para garantizar, por ejemplo, que el marcador no se separe del gen y que la presencia del gen siga dando como resultado la tolerancia al herbicida X. 20

41 c) Creación de marcadores moleculares diferentes para el mismo gen Quizás sea posible elaborar distintas construcciones genéticas que contengan la tolerancia al herbicida X e identificar marcadores moleculares independientes los distintos marcadores para el mismo gen se tratarían como si fuesen distintos métodos para examinar el mismo carácter, a saber, la tolerancia al herbicida X. d) Distintos genes que producen tolerancia al mismo herbicida Que distintos genes serían tratados como distintos métodos para examinar el mismo carácter, a saber, la tolerancia al herbicida X. 20

42 2. Calibración de distancias moleculares en la gestión de colecciones de variedades Se basa en la determinación de los niveles de umbral para marcadores moleculares en función de los niveles de umbral de caracteres tradicionales. Los niveles de umbral de los caracteres tradicionales se basan en una evaluación global de la distancia, en lugar de en un enfoque carácter por carácter y se aplica a la gestión de las colecciones de referencia. El término gestión de las colecciones de referencia abarca la selección de variedades notoriamente conocidas que pueden excluirse del ensayo en cultivo utilizado para examinar la distinción. 20

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44 La primera etapa consiste en determinar el modo de medir la distancia entre las variedades utilizando caracteres tradicionales. Un ejemplo es utilizando el programa informático GAΪA, creado en Francia. De este modo, se establece un umbral a partir de un cierto grado de diferencias con base en caracteres morfológicos. La siguiente etapa es establecer también un umbral, pero ahora con base en distancias genéticas determinadas con marcadores moleculares. El umbral puede establecerse con un adecuado margen de seguridad debido a que las variedades que no se eliminan, pero que son distintas, se descubrirán en el ensayo en cultivo. Este umbral, con un margen de seguridad, se denomina umbral de distinción calificada (umbral plus) para marcadores moleculares. 20

45 Diferencias en los marcadores moleculares (Distancias Genéticas) X u es la frecuencia del alelo u-ésimo en la primera población; Y u es la frecuencia del alelo u-ésimo en la segunda población. Distancia Euclideana, D EU Distancia de Cavalli-Sforza y Edwards (1967), D CH

46 Distancia de Alelos Compartidos, D SA Distancia de Bhattacharyya y Nei (1987), θ 2 Distancia de Sanghvi (1953), χ 2 Distancia de Rogers (1972), D R Distancia de Prevosti (1975), O p Distancia de Nei (1983), D A

47 Cuál es la mejor distancia?... Todos los parámetros de distancia genética tienen ventajas y desventajas en relación a varias propiedades estadísticas y genéticas tales como: a) metricidad, b) errores de muestreo, c) requerimientos computacionales, etc. Metricidad Una distancia entre x and y tiene metricidad si cumple con las siguientes cuatro propiedades: D(x, y) 0 para toda x y y D(x, y) = 0 si y sólo si x = y D(x, y) = D(y, x) para toda x y y D(x, y) D(x, z) + D(y, z) para toda x, y y z [inequidad del triángulo]

48 Umbral molecular Calibración perfecta Distancia morfoógica Umbral morfológico Distancia molecular

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50 Determinando el umbral molecular Un grupo de expertos debe efectuar una evaluación con respecto a un conjunto de pares de variedades, y luego contrastar dicha evaluación con las distancias moleculares. En el caso del maíz, se procedió así: Material: 504 pares de variedades examinadas en paralelo mediante marcadores moleculares Disposición del cultivo: pares de variedades cultivadas en paralelo (1 parcela = 2 hileras de 15 plantas) Evaluación visual por expertos en cultivos del maíz en la escala de similitud: 1. Las dos variedades son similares o muy parecidas 3. Las dos variedades son distintas pero se parecen 5. La comparación es útil, pero las variedades son claramente distintas 7. La comparación no era necesaria. Las variedades son muy diferentes 9. La comparación no era necesaria. Variedades totalmente diferentes

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54 Distinción plus (caracteres tradicionales) Distinción plus (marcadores moleculares) Tipo 1 Sí Sí Tipo 2 No No Tipo 3 Sí No Tipo 4 No Sí Los resultados de los tipos 1 y 2 no tendrán repercusiones en la eficacia de la protección debido a que el resultado es el mismo con los dos métodos utilizados. Los resultados del tipo 3 no tendrán repercusiones en la eficacia de la protección debido a que en el ensayo en cultivo, mediante la utilización de caracteres tradicionales, se descubrirá que las variedades son distintas. Los resultados del tipo 4 pueden tener repercusiones en la eficacia de la protección debido a que pueden ocasionar que se consideren distintas variedades que anteriormente no se hubiesen considerado distintas. Para determinar si los resultados del tipo 4 podrían socavar la eficacia de la protección que se brinda en virtud del sistema de la UPOV se precisaría realizar un análisis de dichos casos.

55 3. Utilización de marcadores moleculares como caracteres. Creación de un nuevo sistema El nuevo sistema se basa en los marcadores STMS (Sequence-tagged microsatelite sites) ( sitios de secuencia marcada por microsatélite ) se utilizan para buscar ciertas secuencias repetidas en el ADN vegetal. En dichos lugares de la secuencia reconocidos por el marcador, el ADN vegetal se amplifica y los fragmentos resultantes se depositan en un gel, que produce un conjunto de bandas o picos correspondientes a cada fragmento. Primer (Forward) Secuencia arbitraria Microsatélite (Unidades repetitivas) Secuencia arbitraria Primer (Reverse)

56 Se propone el siguiente esquema: Etapa 1: Utilizar un conjunto determinado de siete marcadores STMS (conjunto 1) para examinar dos plantas de la variedad candidata a fin de determinar si se diferencia claramente de todas las demás variedades. Si la variedad candidata presenta al menos 3 diferencias de banda/pico en relación con todas las demás variedades tras utilizar este primer conjunto de marcadores, se considerará distinta y podrá cultivarse en un ensayo en cultivo a fin de examinar la homogeneidad y la estabilidad en relación con los caracteres no moleculares pertinentes. En otros casos, o cuando falten valores, se pasará a la etapa 2.

57 Etapa 2: Si la variedad candidata no se considera distinta tras utilizar el conjunto 1 de marcadores, se examinará con otro conjunto diferente de siete marcadores STMS (conjunto 2). Si la variedad candidata presenta al menos 3 diferencias de banda/pico en relación con todas las demás variedades tras utilizar ambos conjuntos de marcadores combinados, se considerará que es distinta y podrá cultivarse en un ensayo en cultivo a fin de examinar la homogeneidad y la estabilidad en relación con los caracteres no moleculares pertinentes. En otros casos, o cuando falten valores para más de un conjunto de marcadores, se pasará a la etapa 3.

58 Etapa 3: Si la variedad candidata no se considera distinta tras utilizar ambos conjuntos de marcadores, es probable que se trate de una variedad existente o de una variedad muy similar genéticamente a una variedad existente, por ejemplo, consecuencia de una mutación. Dichas variedades candidatas podrán incluirse en el ensayo en cultivo a fin de examinar la distinción, la homogeneidad y la estabilidad, utilizando caracteres no moleculares.

59 GRACIAS!!