2ª PRÁCTICA DE MICROBIOLOGÍA:

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1 2ª PRÁCTICA DE MICROBIOLOGÍA: INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA MOLECULAR Y AMBIENTAL INTRODUCCIÓN A. MICROBIOLOGÍA MOLECULAR El objetivo de esta práctica es poder distinguir entre distintos tipos de moléculas de ácidos nucleicos que se puedan obtener al trabajar con microorganismos. Para realizarlo, éstas se separarán en función de su distinto tamaño mediante la técnica conocida como electroforesis, que consiste en hacerlas pasar a través de un sustrato poroso (normalmente un gel de agarosa o de poliacrilamida) mientras se las somete a un campo eléctrico. Los ácidos nucleicos presentan una carga neta negativa (consecuencia de los grupos fosfato que integran el esqueleto del ADN y ARN) y migrarán por el gel hacia el polo positivo del campo eléctrico, de tal forma que las de mayor tamaño se desplazarán más lentamente que aquellas más pequeñas, lo que nos permitirá separarlas y diferenciarlas. A.1 ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS Materiales - Muestras con distintos ácidos nucleicos - Marcadores de peso molecular - Tampón de carga - Micropipetas y puntas - Tubos eppendorf - Gel de agarosa - Cubeta y fuente de electroforesis - Bromuro de etidio (BrEt) - Lámpara de luz ultravioleta 1

2 Procedimiento: 1. Usando unas micropipetas (instrumentos de precisión diseñados para poder tomar volúmenes muy pequeños y exactos de líquidos) mezclaremos, en diferentes tubos, 10 µl de distintas muestras de ácidos nucleicos con 2 µl de tampón de carga. Este tampón confiere a cada muestra una mayor densidad, además de proporcionar un frente visible de color azul que nos servirá como referencia para saber de forma aproximada cómo va corriendo la electroforesis. PRECAUCIÓN: las puntas que se utilizan para coger un volumen con la micropipeta deben cambiarse después de ser usadas, pues de lo contrario contaminaríamos al resto de muestras. 2. Con las mezclas ya dispuestas, se cargan con suavidad los 12 µl de volumen total de cada muestra en los distintos pocillos de un gel de agarosa previamente preparado. Al haber aumentado su densidad, éstas caen sin dificultad al fondo sin difundirse ni diluirse en el tampón de electroforesis donde está sumergido el gel. Dicho tampón es necesario para que fluya la corriente eléctrica. Además, cargaremos también unos pocillos con marcadores de peso molecular, unas mezclas de distintas moléculas de ADN de tamaños conocidos que se utilizan como referencia para deducir el tamaño de las muestras que estamos analizando. 3. Una vez cargadas nuestras muestras y los marcadores, se cierra la cubeta y se activa el campo eléctrico a un determinado voltaje, dejando correr la electroforesis durante el tiempo suficiente para que las moléculas se separen en función de su tamaño. NOTA: como se ha indicado antes, podréis observar cómo los colorantes que componen el tampón de carga van migrando hacia el cátodo, igual que hacen los ácidos nucleicos. 4. Trascurrido el tiempo adecuado, se sumerge el gel en una solución de BrEt, que es un agente químico que se unirá a las distintas moléculas de ácidos nucleicos y nos permitirá visualizarlas al iluminarlas con luz ultravioleta. En este punto se puede fotografiar con la cámara adecuada para poder estudiar las distintas bandas que se observen. A continuación detallaremos muy brevemente la naturaleza de las distintas muestras que vamos a estudiar y las características que observaremos en el gel de electroforesis una vez completado: - El gen del 16S bacteriano, corresponde a la molécula que conforma (junto al 23S y 5S) una de las subunidades del ribosoma de procariotas, encargados de 2

3 la síntesis de proteínas. Su tamaño aproximado suele ser muy constante, de unas pares de bases (pb), aunque el número de genes de 16S puede variar de una especie microbiana a otra. - La región ribosómica espaciadora (llamada ITS) es precisamente el fragmento que separa a los genes 16S y 23S (los cuales suelen estar adyacentes el uno al otro). Su tamaño es variable dependiendo de la especie microbiana, así como el número de genes de 16S, pero suele ser considerablemente menor que el 16S o 23S que tiene a ambos lados. - Un plásmido bacteriano. Los plásmidos son moléculas de ADN que se replican independientemente del cromosoma bacteriano (que es la molécula principal y que contiene el mayor número de genes). Su tamaño es por lo general apreciablemente más pequeño que el cromosoma. Al ser moléculas circulares, en el gel las podemos encontrar en diferentes estados, principalmente superenrolladas (tal cual están normalmente en el interior de las células de donde se extraen) o relajadas (una de las cadenas ha sufrido un corte y se ha perdido el superenrollamiento). Esto afecta a la velocidad de migración de las moléculas, que, aunque son las mismas, no se desplazarán a igual velocidad, por lo que en el gel se puede ver más de una banda. - Una extracción de material genético total. Las células de un microorganismo se lisan (rompen) y su contenido, incluyendo su material genético, se libera al exterior. En el gel se observará una banda de gran tamaño (por encima del límite máximo de los marcadores) que corresponderá a la molécula del cromosoma microbiano. Más abajo se podrán observar los distintos plásmidos (si los hubiera) de menor tamaño. Es posible incluso que en la parte inferior del gel se observe una mancha difusa que correspondería a las diferentes moléculas de ARN que se estaban sintetizando en el momento de la lisis. B. MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL El objetivo de esta práctica es que los alumnos se familiaricen con técnicas básicas de microscopía óptica aplicada a muestras ambientales además de aprender a diferenciar e identificar por tamaño y morfología distintos microorganismos presentes en una muestra natural. 3

4 B.1. LOS MICROORGANISMOS Y SU AMBIENTE: ATRÉVETE A DESCUBRIR!! En esta parte de la práctica los alumnos descubrirán a los microorganismos en su ambiente. Para ello, los alumnos dispondrán de distintas y diversas muestras naturales tales como un estromatolito, muestras de salinas, muestras de una columna de Winogradsky, etc y mediante observaciones en fresco los alumnos irán descubriendo y observando la microbiota natural que habita en cada uno de los ecosistemas. Por otra parte, los alumnos recibirán una pequeña charla a cerca de la importancia de los microorganismos en el ambiente Materiales Asa de siembra Portaobjetos y cubreobjetos Suero fisiológico Aceite de inmersión Microscopio óptico Procedimiento: observación en fresco Hay dos formas distintas de preparar una muestra para su observación en fresco: - A partir de una muestra ambiental líquida: cargar el asa bacteriológica con una gota de muestra líquida, depositarla en un portaobjetos limpio, colocar un cubreobjetos procurando que no queden atrapadas burbujas de aire. - A partir de una muestra ambiental sólida: colocar una gota de suero fisiológico sobre el portaobjetos con ayuda del asa, a continuación cargarla con una pequeña cantidad de bacterias de la muestra y resuspenderla en la gota de suero fisiológico. Colocar por último el cubreobjetos. Una vez preparada la muestra, se lleva al microscopio para su observación. Se utilizará el objetivo de 100X, u objetivo de inmersión, que lleva una banda negra. Para observar las muestras con este objetivo es necesario utilizar aceite de inmersión, que impide la refracción de la luz y permite alcanzar una correcta resolución con los aumentos a los que trabajamos. Se añadirá por tanto una gota de aceite de inmersión sobre el cubre y se procederá al enfoque del microscopio tal como se explicará en la práctica. Cuidado: no utilizar ningún otro objetivo cuando hay aceite de inmersión sobre el cubre, ya que se podría estropear. 4

5 A partir de la observación en fresco, podemos conocer la forma del microorganismo estudiado así como su movilidad. B.2. MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA DE VIRUS Y BACTERIAS DE MUESTRAS AMBIENTALES NATURALES En esta parte de la práctica los alumnos observarán mediante técnicas de microscopia de fluorescencia una muestra de virus y bacterias que han sido previamente preparadas y teñidas con un colorante fluorescente que se une a los ácidos nucleicos. El objetivo fundamental es que aprendan a diferenciar entre un virus y una bacteria y aprecien las diferencias sustanciales de tamaño entre ellos. Los alumnos por turnos en grupos de 6 irán observando las muestras y aprenderán el fundamento del microscopio de fluorescencia. 5