LABORATORIO DE CALIDAD NUTRICIONAL VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS: CASO LOWRY MÓNICA PIZARRO S.

Transcripción

1 LABORATORIO DE CALIDAD NUTRICIONAL VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS: CASO LOWRY MÓNICA PIZARRO S.

2 Es un consorcio de instituciones que aspira reducir la desnutrición y mejorar la seguridad alimentaria nutricional en América Latina y el Caribe. AgroSalud trabaja en la investigación de cultivos biofortificados (Maíz, Fríjol, Arróz y Camote). En este momento AgroSalud esta en el lanzamiento del primer laboratorio en Sur América, especializado en medir la absorción de hierro, zinc, proteína, y vitamina A, a través de métodos in vitro en alimentos mejorados genéticamente.

3 OBJETIVOS TÉCNICA ANALÍTICA VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO ANÁLISIS Y RESULTADOS CONCLUSIONES

4 OBJETIVOS Validar un método analítico para determinar el contenido de proteína soluble, el cual es un indicador del grado de biodisponibilidad. Cuantificar la cantidad de proteína soluble que se encuentra en muestras de fríjol y maíz. Alcanzar uno de las primeras metas necesarias para poder cumplir con las BPL.

5 TÉCNICA ANALÍTICA R

6 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

7 VALIDACIÓN DEL MÉTODO VALIDAR ANALITICO Es verificar documentalmente que un método cumple con los requisitos establecidos. PARÁMETROS DE VALIDACIÓN * Linealidad * Selectividad * Precisión * Robustez * Exactitud * Sensibilidad

8 PARAMETROS APLICADOS SENSIBILIDAD LINEALIDAD EXACTITUD PRECISIÓN

9 VALIDACIÓN DEL MÉTODO LINEALIDAD ANALÍTICO Es la capacidad del método analítico de obtener resultados directamente proporcionales a la concentración del analito dentro de un rango definido. PRECISIÓN Expresa el grado de dispersión entre una serie de mediciones múltiples de una muestra homogénea bajo condiciones establecidas.

10 VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO PRECISIÓN Repetitblidad Precisión Intermedia Precisión Intermedia Repetibilidad Instrumental Repetibilidad del del Método

11 VALIDACIÓN DEL MÉTODO EXACTITUD ANALÍTICO Expresa la cercanía entre el valor aceptado convencionalmente como valor verdadero y el valor experimental encontrado. SENSIBILIDAD La sensibilidad de un método corresponde a la mínima cantidad de analito que puede producir un resultado significativo.

12 ANALISIS Y RESULTADOS LINEALIDAD Se realizó la curva 0.7 y = x de calibración en el 0.6 R 2 = intervalo de 20 a 100 mg/l de proteína. Cada punto de la curva se realizó por triplicado. Absorbancia Concentración de proteína (mg/l)

13 LINEALIDAD Test de Cochran, homogeneidad de varianzas G calculado = ; G tablas (P = 0.05; K=5; n=3)= G calculado < G tablas, las variancias de las concentraciones son homogéneas, el factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados. Normalidad de los residuales Se observa que la distribución de los residuales, es completamente aleatoria No se observa ninguna tendencia Residuales Concentración (mg/l)

14 ANÁLISIS DE VARIANCIA, ANOVA ANOVA gl SS MS F Significance F Regresión E-05 Residual Total Ho = El cuadrado medio de la regresion fue igual al cuadrado medio residual Ha = El cuadrado medio de la regresion fue diferente al cuadrado medio residual F calculado = ; F tablas (P = 0.05) = 5.1E-05 F calculado > F tablas Existe correlación muy significativa entre x e y

15 TEST DE VERIFICACIÓN DE LA PENDIENTE Ho = La pendiente no es significativamente diferente de cero. Ha = La pendiente es significativamente diferente de cero. t calculado = 36.22; t tablas (P = 0.05; n = 5) t calculado > t tablas Existe diferencia significativa entre la pendiente y cero. Intervalo de confianza de la pendiente ± ( ; ) y se observa que este intervalo no incluye el cero.

16 TEST DE VERIFICACIÓN DE LA VARIABLE INDEPENDIENTE O DE PROPORCIONALIDAD Ho = No existe diferencia significativa entre el intercepto y cero. Ha = Existe diferencia significativa entre el intercepto y cero. t calculado = t tablas (P = 0.05; n = 5) t caculado < t tablas La ordenada en el origen es estadísticamente igual a cero Intervalo de confianza del intercepto ± (-0.018, 0.054) y se observa que este intervalo incluye el cero

17 PRECISIÓN Métodos establecidos por la AOAC (Association of Official Analytical Chemist) para comparar coeficientes de variación. Método 1 Método 2 CV (%) = 2 (1 0.5log( C)) Concentración (ppm) CV (%) % Analito Relación Unidades CV (%) 10 10E-1 10% E-2 1% E % E ppm E-5 10 ppm E-6 1 ppm E ppb E-8 10 ppb E-9 1 ppb 30

18 PRECISIÓN Se calculó los coeficientes de variación para cada uno de los parámetros evaluados: Repetibilidad (sistema y método), Precisión Intermedia (método). REPETIBILIDAD DEL SISTEMA Muestra CV (%) REPETIBILIDAD DEL MÉTODO CONCENTRACIÓN ( ppm) CV (%) DIA CV (%) DIA Se observa que los coeficientes de variación son inferiores de 8.4

19 PRECISIÓN INTERMEDIA DEL MÉTODO Muestras de Maíz Dia 1 Dia 1 Dia 2 Dia 2 Dia 3 Dia Analista # CV(%) Dia 1 Dia 1 Dia 2 Dia 2 Dia 3 Dia Analista # CV(%)

20 PRECISION INTERMEDIA DEL MÉTODO Muestras de Fríjol Día 1 Día 1 Día 2 Día 2 Día 3 Día Analista # CV(%) Día 1 Dia 1 Día 2 Día 2 Día 3 Día Analista # CV(%)

21 Muestra de Maíz EXACTITUD 0.4 Absorbancia Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Curva Patron Concentración de proteina (mg/l) curva patrón muestra 1 muestra 2 muestra 3 pendiente

22 PRUEBA t STUDENT EXACTITUD Ho = No hay diferencias significativas entre las pendientes de las curvas de las muestras con adición de patrón y la pendiente de la curva patrón. Ha = Hay diferencias significativas entre las pendientes de las curvas de las muestras con adición de patrón y la pendiente de la curva patrón.

23 t calculado = ; t tablas (P = 0.05;n =3) = t calculado < t tablas Estadísticamenta las pendientes obtenidas de las curvas de adición de patrón son iguales a las de la curva patrón. No hay efectos de matriz en las muestras analizadas.

24 Metodo de adición de patrón Concentración Teórica (mg/l) x x + 20 x + 40 x Absorbancia Media CV(%) Concentración Respuesta exp neta - blanco Interpolación Recuperación (mg/l) (%)

25 Para confirmar que la recuperación es satisfactoria se aplica un test de t. Ho = Que el % de recuperación es significativamente igual al 100 % de recuperación Ha = Que el % de recuperación es significativamente diferente al 100 % de recuperación t calculado = 2.17; t tablas (P = 0.05; n =2) = 4.30 t calculado < t tablas Se concluye: el % de recuperación representa el 100 % de recuperación

26 PARA FRÍJOL EXACTITUD Absorbancia Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Curva Patron Concentración de proteina (mg/l) curva patrón muestra 1 muestra 2 muestra 3 pendiente

27 Prueba t Student EXACTITUD Ho = No hay diferencias significativas entre las pendientes de las curvas de las muestras con adicion de patron y la pendiente de la curva patron. Ha = Hay diferencias significativas entre las pendientes de las curvas de las muestra con adicion patron y la pendiente de la nueva curva patron..

28 t calculado = ; t tablas (P = 0.05; n = 3) 4.30 t calculado < t tablas Estadisticamenta las pendientes obtenidas de las curvas de adición de patrón son iguales a la de la curva patrón. Se concluye que no hay efectos de matriz en las muestras analizadas.

29 MÉTODO DE ADICIÓN DE PATRÓN Concentración Teórica (mg/l) x x + 20 x + 40 x Absorbancia Media CV(%) Concentración Respuesta exp neta - blanco Interpolación Recuperación (mg/l) (%) Media CV% 6.11

30 Para confirmar que la recuperación es satisfactoria se aplica un test de t. Ho = Que el de recuperaciones significativamente igual al 100 % de recuperacion Ha = Que el de recuperaciones s ignificativamente igual al 100 % de recuperacion t calculado = t tablas (α = 0.05; gl =2) = t calculado < t tablas Se concluye: el % obtenido representa el 100 % de recuperación

31 SENSIBILIDAD LD= y bl + 3 b n s bl y LC= bl + 10 b n s bl Método de Bajas Concentraciones Limite de detección = 4.8 mg/l Limite de cuantificación = 6.27 mg/l

32 CONCLUSIONES De acuerdo a los análisis de linealidad, exactitud, precisión y sensibilidad se puede concluir que el método de Lowry puede ser utilizado para la valoración cuantitativa de proteína en muestras de fríjol y maíz. Estos son los primeros pasos para lograr que el futuro laboratorio de Agrosalud alcance la certificación.

33 AGRADECIMIENTOS Al laboratorio de Mejoramiento de yuca por su apoyo en la realización de este trabajo y por facilidad en el uso de los equipos y de sus instalaciones. Al proyecto de Agrosalud por permitirme realizar este trabajo, especialmente a Darwin Ortiz por su guía profesional.