ANÁLISIS DE ALIMENTOS ANALÍTICOS

Transcripción

1 ANÁLISIS DE ALIMENTOS VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS Dra. Roxana Verdini f 2016

2 CALIDAD EN EL LABORATORIO DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS Los laboratorios de análisis instrumental de alimentos, propiedades físicas y microbiología pueden prestar servicios a clientes internos y externos de análisis fisicoquímico y microbiológico para muestras de alimentos. Acorde a la política de calidad, los laboratorios de análisis deben trabajar con el objetivo de generar y garantizar resultados confiables.

3 CALIDAD EN EL LABORATORIO DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS El trabajo realizado en los laboratorios bajo los lineamientos establecidos en la norma ISO/IEC 17025:2005, (NORMA ARGENTINA IRAM 301* ISO/IEC 17025) garantiza el mejoramiento continuo, para el logro de la eficacia y eficiencia en los objetivos del Sistema de Gestión de Calidad. También EURACHEM que es una red de organizaciones en Europa, que tiene el objetivo de establecer un sistema de trazabilidad internacional de las mediciones químicas y la promoción de buenas prácticas de calidad, proporciona una Guía de Laboratorio para la Validación de Métodos y Temas Relacionados.

4 EURACHEM Proporciona un foro para la discusión de los problemas comunes y para el desarrollo de un enfoque informado y considerado que considera cuestiones técnicas y políticas de decisión. Promueve las mejores prácticas en la medición analítica mediante la producción de una guía autorizada dentro de sus grupos de expertos, guías de publicación enlaweb y el apoyo a talleres para comunicar las buenas prácticas.

5 EURACHEM La orientación incluye cuestiones técnicas como la evaluación de la incertidumbre de medición, validación de métodos y ensayos de aptitud. También trabaja a través del enlace con los organismos de acreditación y otras organizaciones con intereses en la calidad de la medición para ayudar a asegurar políticas prácticas de acreditación y promoción de las provisiones técnicas sensibles en la regulación.

6 IRAM 301* ISO/IEC Esta norma establece los requisitos generales para la competencia en la realización de ensayos o de calibraciones, incluido el muestreo. Cubre los ensayos y las calibraciones que se realizan utilizando: métodos normalizados, métodos no normalizados, métodos desarrollados por el propio laboratorio.

7 IRAM 301* ISO/IEC Organización Sistema de gestión Control de los documentos Revisión de los pedidos, ofertas y contratos Subcontratación de ensayos y de calibraciones Compras de servicios y de suministros Servicio al cliente Control de trabajos de ensayos o de calibraciones no conformes Mejora Acciones correctivas Acciones preventivas Control de los registros Auditorías internas Revisiones por la dirección

8 ORGANIZACIÓN Debe ser una entidad con responsabilidad legal y tener una dirección técnica con responsabilidad total... Debe realizar sus actividades de ensayo y de calibración de modo que se cumplan los requisitos de esta norma... Debe tener personal que tenga los recursos necesarios para desempeñar sus tareas... Debe tomar medidas para asegurarse de que su personal están libres de cualquier presión o influencia indebida... Debe tener políticas y procedimientos para asegurar la protección de la información confidencial y los derechos de propiedad de sus clientes... Debe proveer adecuada supervisión al personal encargado de los ensayos y calibraciones...

9 SISTEMA DE GESTIÓN Debe establecer, implementar y mantener un sistema de gestión apropiado al alcance de sus actividades. Debe documentar sus políticas, sistemas, programas, procedimientos i e instrucciones i tanto t como sea necesario para asegurar la calidad de los resultados de los ensayos o calibraciones. La documentación del sistema debe ser comunicada al personal pertinente, debe ser comprendida por él, debe estar a su disposición y debe ser implementada por él.

10 SUBCONTRATACIÓN DE ENSAYOS Y DE CALIBRACIONES Cuando un laboratorio subcontrate un trabajo, se debe encargar este trabajo a un subcontratista competente Un subcontratista competente es el que, por ejemplo, cumple esta norma para el trabajo en cuestión

11 COMPRAS DE SERVICIOS Y DE SUMINISTROS Deben existir procedimientos para la compra, la recepción y el almacenamiento de los reactivos y materiales consumibles de laboratorio que se necesiten para los ensayos y las calibraciones El laboratorio debe asegurarse de que los suministros, los reactivos y los materiales consumibles comprados, que afectan a la calidad de los ensayos o de las calibraciones, no sean utilizados hasta que no hayan sido inspeccionados

12 SERVICIO AL CLIENTE El laboratorio debe estar dispuesto a cooperar con los clientes o sus representantes para aclarar el pedido del cliente y para realizar el seguimiento del desempeño del laboratorio en relación con el trabajo realizado siempre que el laboratorio garantice la confidencialidad hacia otros clientes Los clientes valoran el mantenimiento de una buena comunicación, el asesoramiento y los consejos de orden técnico, así como las opiniones e interpretaciones basadas en los resultados El laboratorio debe procurar obtener información de retorno, tanto positiva como negativa, de sus clientes La información de retorno debe utilizarse y analizarse para mejora rel sistema de gestión, las actividades de ensayo y calibración y el servicio al cliente

13 QUEJAS El laboratorio debe tener una política y un procedimiento para la resolución de las quejas recibidas de los clientes o de otras partes. Se deben mantener los registros de todas las quejas así como de las investigaciones y de las acciones correctivas llevadas a cabo por el laboratorio

14 CONTROL DE TRABAJOS DE ENSAYOS O DE CALIBRACIONES NO CONFORMES El laboratorio debe tener una política y procedimientos que se deben implementar cuando cualquier aspecto de su trabajo de ensayo o de calibración, o el resultado de dichos trabajos, no son conformes con sus propios procedimientos o con los requisitos acordados con el cliente Cuando la evaluación indique que el trabajo no conforme podría volver a ocurrir o existan dudas sobre el cumplimiento de las operaciones del laboratorio con sus propias políticas y procedimientos, se deben seguir rápidamente los procedimientos de acciones correctivas

15 las quejas de los clientes las auditorías internas o externas el control de la calidad las revisiones por la dirección CÓMO IDENTIFICAR TRABAJOS NO CONFORMES O PROBLEMAS? la calibración de instrumentos el control de los informes de ensayo y certificados de calibración la observación o la supervisión del personal el control de los materiales consumibles

16 ACCIONES CORRECTIVAS Cuando se necesite una acción correctiva, el laboratorio debe identificar las acciones correctivas posibles Debe seleccionar e implementar la o las acciones con mayor posibilidad de eliminar el problema y prevenir su repetición Las acciones correctivas deben corresponder en importancia a la magnitud del problema y sus riesgos El laboratorio debe documentar e implementar El laboratorio debe documentar e implementar cualquier cambio necesario que resulte de las investigaciones de las acciones correctivas.

17 AUDITORÍAS INTERNAS El laboratorio debe efectuar, periódicamente, de acuerdo con un calendario y un procedimiento predeterminados, auditorías internas de sus actividades para verificar que sus operaciones continúan cumpliendo los requisitos del sistema de gestión y de esta norma. El programa de auditoría interna debe considerar todos los elementos del sistema de gestión, incluidas las actividades de ensayo y calibración

18 EXACTITUD Y CONFIABILIDAD DE LOS ENSAYOS O DE LAS CALIBRACIONES Intervienen factores: humanos, instalaciones y condiciones ambientales. El grado con el que los factores contribuyen a la incertidumbre total de la medición difiere considerablemente según los ensayos y calibraciones. El laboratorio debe tener en cuenta estos factores al desarrollar los métodos y procedimientos de ensayo y de calibración, en la capacitación y la calificación del personal, así como en la selección y la calibración de los equipos utilizados.

19 PERSONAL La dirección del laboratorio debe asegurar la competencia de todos los que operan equipos específicos, realizan ensayos o calibraciones, evalúan los resultados y firman los informes de ensayos y los certificados de calibración. Cuando emplea personal en formación, debe proveer una supervisión apropiada. p El personal que realiza tareas específicas debe estar calificado sobre la base de una educación, una capacitación, una experiencia apropiadas y de habilidades demostradas, según sea requerido.

20 INSTALACIONES Y CONDICIONES AMBIENTALES Las instalaciones de ensayos o de calibraciones del laboratorio, incluidas, pero no en forma excluyente, las fuentes de energía, la iluminación y las condiciones ambientales, deben facilitar la realización correcta de los ensayos o de las calibraciones. El laboratorio debe asegurarse de que las condiciones ambientales no invaliden los resultados ni comprometan la calidad requerida de las mediciones. Se deben tomar precauciones especiales cuando el muestreo y los ensayos o las calibraciones se realicen en sitios distintos de la instalación permanente del laboratorio.

21 INSTALACIONES Y CONDICIONES AMBIENTALES Debe haber una separación eficaz entre áreas vecinas en las que se realicen actividades incompatibles. Se deben tomar medidas para prevenir la contaminación cruzada. Se deben controlar el acceso y el uso de las áreas que afectan a la calidad de los ensayos o de las calibraciones. El laboratorio debe determinar la extensión del control en función de sus circunstancias particulares. Se deben tomar medidas para asegurar el orden y la limpieza del laboratorio. Cuando sean necesarios se deben preparar procedimientos especiales.

22 QUÉ MÉTODOS USAR? El laboratorio debe utilizar los métodos de ensayo o de calibración, incluidos los de muestreo, que satisfagan las necesidades d del cliente y que sean apropiados para los ensayos o las calibraciones que realiza. Se deben utilizar preferentemente los métodos publicados como normas internacionales, regionales o nacionales. El laboratorio debe asegurarse de que utiliza la última versión vigente de la norma, a menos que no sea apropiado o posible. Cuando sea necesario, la norma debe ser complementada con detalles adicionales i para asegurar una aplicación coherente.

23 QUÉ MÉTODOS USAR? El cliente debe ser informado del método elegido. El laboratorio debe confirmar que puede aplicar correctamente los métodos normalizados antes de utilizarlos para los ensayos o las calibraciones. Si el método normalizado cambia, se debe repetir la confirmación. También se pueden utilizar los métodos desarrollados por el laboratorio si son apropiados para el uso previsto y si han sido validados.

24 SE PUEDEN APLICAR MÉTODOS DESARROLADOS EN EL LABORATORIO? La introducción de los métodos de ensayo y de calibración desarrollados por el laboratorio para su propio uso debe ser una actividad planificada y debe ser asignada a personal calificado, provisto de los recursos adecuados Cuando sea necesario utilizar métodos no normalizados, éstos deben ser acordados con el cliente y deben incluir una especificación clara de los requisitos del cliente y del objetivo del ensayo o de la calibración. Los métodos desarrollados debe haber sido validados Los métodos desarrollados debe haber sido validados adecuadamente antes del uso.

25 DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO Una identificación apropiada El alcance La descripción ió del tipo de ítem a ensayar o a calibrar Los parámetros o las magnitudes y los rangos a ser determinados Los aparatos y equipos, incluidos los requisitos técnicos de funcionamiento Los patrones de referencia y los materiales de referencia requeridos Las condiciones ambientales requeridas y cualquier período de estabilización que sea necesario La descripción del procedimiento

26 MEDICIONES ANALÍTICAS La EURACHEM resume en seis principios la buena práctica de laboratorio en las mediciones analíticas Las mediciones analíticas deben realizarse para satisfacer un requisito acordado (es decir, con un objetivo definido). Las mediciones analíticas deben realizarse utilizando métodos y equipos que han sido probados para asegurar que son adecuados a su propósito. p El personal que realiza las mediciones analíticas debe ser calificado y competente para emprender la tarea asignada (y demostrar que pueden desempeñar el análisis apropiadamente).

27 MEDICIONES ANALÍTICAS La EURACHEM resume en seis principios la buena práctica de laboratorio en las mediciones analíticas Deberá existir una evaluación periódica e independiente del desempeño técnico de un laboratorio. Las mediciones analíticas hechas en un laboratorio deben ser consistentes con aquéllas que se realicen en cualquier otro laboratorio. Las organizaciones que hacen mediciones analíticas deben tener procedimientos bien definidos de control y de aseguramiento de calidad.

28 VALIDACIÓN La ISO define a la validación como la confirmación, a través del examen y el aporte de evidencias objetivas, de que se cumplen los requisitos iit particulares para un uso específico previsto. El laboratorio debe validar los métodos no normalizados, ados los métodos que diseña o desarrolla, los métodos normalizados empleados fuera del alcance previsto, así como las ampliaciones i y modificaciones i de los métodos normalizados, para confirmar que los métodos son aptos para el fin previsto. La validación debe ser tan amplia como sea necesario para satisfacer las necesidades del tipo de aplicación o del campo de aplicación dados.

29 VALIDACIÓN Es conveniente utilizar una o varias de las técnicas siguientes para la determinación del desempeño de un método: calibración utilizando patrones de referencia o materiales de referencia, comparación con resultados obtenidos con otros métodos, comparaciones interlaboratorios, evaluación sistemática de los factores que influyen en el resultado; evaluación de la incertidumbre de los resultados basada en el conocimiento científico de los principios teóricos del método y en la experiencia práctica.

30 VALIDACIÓN La gama y la exactitud de los valores que se obtienen empleando métodos validados tal como fueron fijadas para el uso previsto, it deben responder a las necesidades d de los clientes. incertidumbre de los resultados límite de detección selectividad del método linealidad repetibilidad o de reproducibilidad robustez ante influencias externas sensibilidad cruzada frente a las interferencias provenientes de la matriz de la muestra o del objeto de ensayo

31 VALIDACIÓN Enfoque de la EURACHEM La existencia de métodos analíticos confiables para la realización de ensayos de laboratorio es indispensable para el control de calidad e inocuidad de los alimentos. La confiabilidad de un método se determina mediante procesos de validación. La validación de un método es un requisito importante en la práctica del análisis químico. Hay varias preguntas: porqué debe hacerse? cuándo debe hacerse? que necesita hacerse?

32 VALIDACIÓN - Enfoque de la EURACHEM Algunos analistas ven la validación de métodos como algo que sólo puede hacerse en colaboración con otros laboratorios y por consiguiente no la realizan. Por ejemplo la comisión ió del Codex Alimentarius i requiere para que un método sea incluido ciertos datos sobre la perfomance del mismo tales como: especificidad, exactitud, precisión (repetitividad, reproducibilidad), límite de detección, sensibilidad, aplicabilidad, practicidad, etc. Este proceso de validación requiere extensos estudios colaborativos. Estos procesos de validación son muy complejos y pueden requerir el análisis de 5 o más muestras y la participación de 8 o más laboratorios. Sin embargo no siempre los métodos incluidos en algunas normas han sido sometidos a una validación tan compleja.

33 VALIDACIÓN - Enfoque de la EURACHEM Qué es la validación? Según ISO la validación es la confirmación mediante examen y suministro de evidencia objetiva de que se cumplen los requisitos particulares para un uso específico previsto (ISO 8402:1994). Ésta se puede interpretar para la validación de un método como el proceso de definir una necesidad analítica y confirmar que el método en cuestión tiene capacidades de desempeño consistentes t con las que requiere la aplicación. ió Está implícita la necesidad de evaluar las capacidades de desempeño del método. El criterio de la conveniencia del método es importante.

34 VALIDACIÓN - Enfoque de la EURACHEM En el pasado la validación del método tendía a concentrarse sobre el proceso de evaluación de los parámetros de desempeño. En el proceso de validación del método está implícito que: Los estudios para determinar los parámetros de desempeño se realizan usando equipos dentro de especificaciones, que están trabajando correctamente y que están calibrados adecuadamente. El operador que realiza los estudios debe ser técnicamente competente en el campo de trabajo bajo estudio y debe poseer suficiente conocimiento sobre el trabajo a realizar con el fin de que sea capaz de tomar decisiones apropiadas a partir de las observaciones hechas mientras avanza el estudio.

35 VALIDACIÓN - Enfoque de la EURACHEM VALIDACIÓN Y DESARROLLO Generalmente se considera que la validación del método está ligada estrechamente con el desarrollo del método. No es fácil determinar exactamente donde termina el desarrollo del método y donde empieza la validación. Por lo general, muchos de los parámetros de desempeño del método que están asociados a su validación ió son evaluados, como parte del desarrollo del método.

36 POR QUÉ ES NECESARIA LA VALIDACIÓN DE UN MÉTODO? Importancia de las mediciones analíticas Millones de mediciones analíticas se realizan diariamente en miles de laboratorios alrededor del mundo con diversos fines: evaluar bienes para propósitos de comercio, como apoyo a la salud, para verificar la calidad del agua para consumo humano, para el análisis de la composición elemental de una aleación para confirmar su conveniencia en la construcción de aeronaves, en análisis forenses de fluidos corporales en investigaciones criminales.

37 POR QUÉ ES NECESARIA LA VALIDACIÓN DE UN MÉTODO? Importancia de las mediciones analíticas El costo de realizar estas mediciones es elevado y surgen costos adicionales de las decisiones tomadas en base a los resultados. Por ejemplo, las pruebas que muestran que algún alimento no es adecuado para su consumo pueden resultar en demandas por compensación; pruebas que confirmen la presencia de drogas prohibidas podrían ocasionar multas, encarcelamiento omás aún, laejecución enalgunos países. Claramente es importante determinar el resultado correcto y ser capaz de demostrar que lo es.

38 EL DEBER PROFESIONAL DEL QUÍMICO ANALÍTICO El cliente espera poder confiar en los resultados reportados y por lo general sólo los cuestiona cuando surge una controversia. De este modo, el laboratorio y su personal tienen una clara responsabilidad de corresponder a la confianza del cliente proporcionando la respuesta correcta a la parte analítica del problema, en otras palabras, proporcionando resultados que han demostrado ser adecuados a su propósito. Esto lleva implícito que las pruebas realizadas son apropiadas para la parte analítica del problema que el cliente desea resolver y que el informe final presenta los datos analíticos de tal manera que el cliente pueda entenderlos fácilmente y sacar conclusiones apropiadas. La validación del método permite a los químicos demostrar que el método es adecuado para su propósito.

39 EL DEBER PROFESIONAL DEL QUÍMICO ANALÍTICO Para que un resultado analítico concuerde con el propósito requerido, debe ser lo suficientemente confiable para que cualquier decisión basada en éste pueda tomarse con confianza. Así, el desempeño del método debe validarse y debe estimarse la incertidumbre del resultado a un nivel de confianza dado. La incertidumbre deberá ser evaluada y establecida de una forma que sea ampliamente reconocida, consistente t de forma interna y fácil de interpretar. La mayor parte de la información requerida para evaluar la La mayor parte de la información requerida para evaluar la incertidumbre se puede obtener durante la validación del método.

40 ALGUNAS DEFINICIONES La exactitud expresa la cercanía de un resultado al valor verdadero. La validación de un método busca cuantificar la exactitud probable de los resultados evaluando tanto los efectos sistemáticos como los aleatorios sobre los resultados. Normalmente la exactitud se estudia en dos componentes: la veracidad ylaprecisión. La veracidad (de un método) es una expresión de que tan cercana se encuentra la media de un conjunto de resultados (producidos por el método) respecto del valor real. N l t l id d té i d Normalmente, la veracidad se expresa en términos de sesgo.

41 ALGUNAS DEFINICIONES La precisión es una medida de que tan cercanos están los resultados unos con respecto a los otros y por lo general se expresa mediante medidas tal como la desviación estándar la cual describe la dispersión de los resultados.

42 ALGUNAS DEFINICIONES Adicionalmente, una expresión cada ves más común de exactitud es la incertidumbre de medición, la cual proporciona una figura única de expresión de la exactitud. La evaluación práctica de la veracidad se fundamenta en la comparación de la media de los resultados de un método con relación a valores conocidos, es decir, la veracidad se determina contra un valor de referencia (o sea, un valor verdadero o un valor verdadero convencional).

43 ALGUNAS DEFINICIONES Se dispone de dos técnicas básicas: la verificación con respecto a los valores de referencia de un material caracterizado, la verificación con respecto de otro método caracterizado.

44 ALGUNAS DEFINICIONES Los valores de referencia son idealmente trazables a patrones internacionales. Los materiales de referencia certificados por lo general se aceptan como medio de proveer valores trazables y por lo tanto, el valor de referencia es el valor certificado. Para verificar la veracidad utilizando un material de referencia, se determina la media y la desviación estándar de una serie de réplicas de una prueba y se compara contra el valor caracterizado del material de referencia.

45 ALGUNAS DEFINICIONES El material de referencia ideal sería un material de referencia certificado de matriz natural, muy semejante a las muestras de interés. Claramente la disponibilidad de estos materiales es limitada. Los materiales de referencia para una validación pueden ser por consiguiente: preparados por adición de materiales típicos con materiales de referencia de pureza certificada u otros materiales de pureza y estabilidad adecuadas, materiales típicos bien caracterizados, de estabilidad verificada internamente y conservados para control de calidad interno.

46 ALGUNAS DEFINICIONES Normalmente, la precisión se determina para circunstancias específicas las cuales en la práctica pueden ser muy variadas. Las medidas de precisión más comunes son la repetibilidad yla reproducibilidad. La repetibilidad dará una idea de la clase de variabilidad esperada cuando un método se ejecuta por un solo analista, con un equipo en un período corto de tiempo. Si la muestra se analiza por varios laboratorios para fines comparativos, entonces una medida de precisión más significativa a usarse es la reproducibilidad.

47 ALGUNAS DEFINICIONES Tanto la reproducibilidad como la repetibilidad dependen generalmente de la concentración del analito y deben determinarse a varias concentraciones y de ser pertinente, deberá establecerse la relación entre la precisión y la concentración del analito. La desviación estándar relativa puede ser más útil en este caso puesto que la desviación estándar dividida por la concentración es prácticamente constante dentro del intervalo de interés, a condición de que éste no sea demasiado grande

48 ALGUNAS DEFINICIONES La sensibilidad es efectivamente la pendiente de la curva de respuesta, es decir, el cambio en la respuesta del instrumento que corresponde a un cambio en la concentración del analito. Cuando se ha establecido que la respuesta es lineal con respecto a la concentración (o sea, dentro del intervalo lineal del método) y se ha determinado la intercepción de la curva de respuesta, la sensibilidad es un parámetro útil para calcular y usar en fórmulas de cuantificación. La robustez es una medida de la efectividad del método analítico es quétanbuendesempeño se mantiene aun sin una implementación perfecta.

49 LA CURVA DE CALIBRACIÓN El análisis mediante recta de calibración puede hacerse cuando sólo el analito de interés presenta señal analítica o respuesta (absorbancia, fluorescencia, potencial eléctrico, corriente, etc.), o cuando la señal del blanco es constante. Las etapas que deben seguirse en un análisis mediante recta de calibración son: determinación del extremo superior del rango lineal preparación de patrones medición de la respuesta de los patrones estimación de los parámetros de la regresión cálculo de las cifras de mérito del método predicción en muestras incógnita

50 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Determinación del extremo superior del rango lineal Esta etapa es fundamental, ya que la regresión lineal está basada en la suposición de que los datos de respuesta analítica están linealmente relacionados con la concentración del analito. Si se sospecha que existen desvíos de la linealidad, se recomienda realizar un análisis exploratorio previo cuyo objeto es extender el rango deaplicabilidad de la técnica analítica a la máxima concentración posible. En dicho análisis, se incluyen patrones de concentración conocida del analito desded cero hasta valores que se desvíen visiblemente de la linealidad.

51 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Preparación de patrones Una vez estimado el extremo superior del rango lineal de la técnica, deben prepararse patrones de concentración conocida dentro de dicho rango, e incluyendo el valor cero de concentración del analito (blanco). Usualmente, se preparan varios patrones (como mínimocinco) con concentraciones igualmente espaciadas entre cero y el extremo superior del rango lineal, y cada patrón se analiza por triplicado. Debe ponerse especial cuidado en la preparación de los patrones del analito para la calibración, de manera que las concentraciones de calibrado se conozcan con la máxima precisión posible.

52 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Preparación de patrones Este requisito se relaciona con el hecho de que la recta de regresión se ajusta mediante ecuaciones que suponen que los valores del eje x (concentraciones) tienen una incertidumbre considerablemente menor que los del eje y (respuestas). Por ejemplo, si se realizan mediciones de absorbancia como respuesta, podemos suponer que el nivel de incertidumbre en la respuesta puede ser de alrededor de 0, unidades d deabsorbancia. b Si los valores de las respuestas son, en promedio, de 1 unidad de absorbancia, esto implica un nivel relativo de incertidumbre de aproximadamente 0,5% en la respuesta.

53 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Preparación de patrones Por lo tanto, se deben preparar patrones de calibrado cuyas concentraciones se conozcan con un error menor al 0,5%. Preparar soluciones de calibrado, por ejemplo, con incertidumbres del orden del 0,1% en promedio, requiere pesar más de 100 mg de reactivo, preparar soluciones en matraces calibrados de al menos 100 ml, tomar alícuotas con pipetas aforadas calibradas, etc.

54 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Medición de la respuesta de los patrones Una vez preparados los patrones de concentración conocida, se miden sus respuestas analíticas, incluyendo réplicas de cada medición. Usualmente cada patrón se mide por triplicado. Es importante establecer la siguiente nomenclatura: si se emplean 6 patrones, cada uno por triplicado, entonces el número de niveles diferentes de concentración (p) es 6, y el número total de puntos de la recta de calibrado (m) es 18.

55 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Estimación de los parámetros de la regresión El análisis de los datos de calibrado mediante regresión lineal implica el cálculo de la pendiente (A) y ordenada al origen (B) de la recta ajustada a la ecuación y = A x + B. Los valores estimados de A y B se calculan mediante las Los valores estimados de A y B se calculan mediante las siguientes ecuaciones:.

56 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Estimación de los parámetros de la regresión El análisis de los datos de calibrado mediante regresión lineal implica el cálculo de la pendiente (A) y ordenada al origen (B) de la recta ajustada a la ecuación y = A x + B. Los valores estimados de A y B se calculan mediante las Los valores estimados de A y B se calculan mediante las siguientes ecuaciones:.

57 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Estimación de los parámetros de la regresión Además de los valores individuales de A y B, es importante tener una idea de su incertidumbre asociada, ya que los datos instrumentales llevan asociados un error que depende del ruido instrumental, y el ajuste por cuadrados mínimos sólo provee estimaciones de la pendiente y ordenada al origen. Los desvíos estándar en los parámetros A y B se Los desvíos estándar en los parámetros A y B se calculan con las siguientes ecuaciones:

58 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Estimación de los parámetros de la regresión En las ecuaciones precedentes, el parámetro sy/x es el desvío estándar de los residuos de la regresión y está dado por:

59 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Estimación de los parámetros de la regresión donde yi es la respuesta experimental de cada patrón de calibrado e yˆi representa la respuesta estimada en cada punto, esto es, yˆi yi= A xi + B. Se emplean m 2 grados de libertad, ya que hay m datos disponibles, y 2 parámetros estimados en la regresión (A y B). Estos parámetros estadísticos dan también una idea de la bondad de la regresión. Es deseable que sy/x sea lo más pequeña posible; no

60 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Estimación de los parámetros de la regresión Es deseable que sy/x sea lo más pequeña posible; no obstante su valor está limitado por el ruido instrumental. La distribución de los residuos, es decir, el modo en que los valores de (yi yˆi yi) varían con la respuesta, cumple también un papel importante en el análisis de la adecuación de los datos al modelo lineal.

61 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Cifras de mérito del método Las cifras de mérito de un método analítico se utilizan regularmente con el propósito de calificar un determinado método y comparar sus propiedades analíticas con las provistas por otras técnicas. Incluyen, entre otras, las siguientes: sensibilidad de calibración sensibilidad analítica límite de detección límite de cuantificación rango dinámico rango lineal

62 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Sensibilidad La sensibilidad de calibración no es adecuada para comparar dos métodos analíticos cuando estos están basados en respuestas de diferente naturaleza (por ejemplo, absorbancia y fluorescencia, o absorbancia y medidas electroquímicas, etc.). Para ello es preferible utilizar la llamada sensibilidad analítica γ, definida por la relación entre la sensibilidad y el ruido instrumental: donde sy es una medida conveniente del nivel de ruido en la respuesta.

63 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Sensibilidad Para estimar el nivel de ruido pueden usarse dos procedimientos, que en teoría deberían coincidir. En el primero, se estima el ruido instrumental (sy) a través de los desvíos de las réplicas de las mediciones de calibrado respecto de sus promedios. En el segundo método de estimación del nivel de ruido, se lo estima como el desvío estándar de los residuos de la regresión lineal, el parámetro ya definido sy/x

64 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Límite de detección (LOD) Es la mínima concentración detectable de manera confiable por la técnica. En la definición moderna, el límite de detección (LOD) se calcula en función del desvío estándar de la concentración predicha para una muestra blanco (s0) n

65 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Límite de detección (LOD) De este modo, el LOD está dado por: LOD = 2 t0,05,m 2, s0(13) definición que ha sido adoptada también por IUPAC e ISO. En la práctica, dado que m es un número relativamente grande, el valor de (2 t0,05,m 2), tiende a 3,3,, por lo que una ecuación aproximada para el límite de detección es LOD = 3,3 s0

66 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Límite de cuantificación (LOQ) Es la mínima concentración cuantificable en forma confiable. Este parámetro (LOQ) se toma como la concentración correspondiente a 10 veces el desvío estándar (en unidades de concentración) del blanco, con lo cual: LOQ = 10 s0 De este modo, el desvío estándar relativo (DSR) para una concentración igual al LOQ es del 10%, nivel que se toma convencionalmente como el máximo DSR aceptable para cuantificar el analito en una muestra.

67 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Rango dinámico Se considera que va desde la menor concentración detectable (el LOD) hasta la pérdida de relación entre respuesta y concentración. El rango dinámico es también el rango de aplicabilidad de la técnica. En la zona de pérdida de la linealidad, podría aplicarse, en principio, un método de regresión polinómica para la calibración (o algún otro de naturaleza no lineal), de modo que nada impide que dicha zona sea utilizada con propósitos predictivos.

68 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Rango dinámico

69 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Rango lineal Se considera que el rango lineal comprende desde la menor concentración que puede medirse (el LOQ) hasta la pérdida de la linealidad. La prueba estadística que se utiliza para determinar si los datos se ajustan a la ley lineal es la F: en primer lugar se calcula un valor "experimental" de F, dado por:

70 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Rango lineal Luego se compara este valor con el crítico que se encuentra en tablas de F (de una cola) para m 2 y m p grados de libertad, y un determinado nivel de confianza, por ejemplo 95%. Si Fexp < F, se acepta que los datos se comportan linealmente. Alternativamente, se calcula la probabilidad pf asociada Alternativamente, se calcula la probabilidad pf asociada a este valor de Fexp, y se considera que la prueba de linealidad es aceptada si pf > 0,05.

71 LA CURVA DE CALIBRACIÓN

72 LA CURVA DE CALIBRACIÓN Otro parámetro obtenido en el análisis de regresión es el coeficiente de determinación o de regresión, R 2. El coeficiente casi siempre tiene un valor cercano a la unidad, que es el máximo valor que puede alcanzar. Pero no debe mal interpretarse puesto que un coeficiente de correlación de 1, no necesariamente significa que la linealidad sea buena, sino que el numerador y el denominador de la expresión anterior se cancelan mutuamente. El coeficiente de correlación sólo es otro indicio adicional que debe sumarse al análisis de los residuos.

73 BIBLIOGRAFÍA. NORMA ARGENTINA IRAM 301* ISO/IEC Cuarta edición Guía de Laboratorio para la Validación de Métodos y Temas Relacionados. EURACHEM Disponible en: Guia-Validacion-CNM-MRD-030-2da-Ed.pdf La Calibración en Química Analítica. Goicoechea, HC y Olivieri, AC. Editorial UNL, 2007.