PLATELIA Parvovirus B19 IgM

Transcripción

1 PLATELIA Parvovirus B19 IgM Detección cualitativa de anticuerpos del Parvovirus B19 IgM en suero y plasma humano mediante un inmunoensayo enzimático.

2 TABLA DE CONTENIDOS 1- CAMPO DE APLICACIÓN RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO REACTIVOS PRECAUCIONES DE USO MUESTRAS MATERIALES NECESARIOS INSTRUCCIONES DE USO CONTROL DE CALIDAD INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS LIMITACIONES DE LA PRUEBA CARACTERÍSTICAS DEL RENDIMIENTO REFERENCIAS... 36

3 1- CAMPO DE APLICACIÓN Platelia Parvovirus B19 IgM es una prueba inmunoenzimática de tipo ELISA que utiliza la inmunocaptura para la detección cualitativa de anticuerpos IgM producidos contra Parvovirus B19 (PVB19) en suero o plasma humano. La prueba debe utilizarse como una ayuda para el diagnóstico de infección de Parvovirus B19 y conjuntamente con el historial clínico del paciente. 2- RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA Parvovirus B19 (PVB19) es el único virus de la familia parvoviridae que infecta a los humanos. Es un virus pequeño, icosaédrico y con ADN monocatenario, envuelto en una cápside sin cubierta vírica. El genoma B19 es especialmente codificador para dos proteínas estructurales de cápside VP1 (83kDA) y VP2 (53kDA), y una proteína no estructural, NS-1, necesaria para la réplica y propagación del virus en la célula.parvovirus B19 es ubicuo y se contagia endémicamente en todo el mundo. La seroprevalencia varía del 2-10% en niños menores de 5 años hasta el 50-70% en la edad adulta. Se propaga principalmente por medio de las gotitas respiratorias, pero también puede transmitirse a través de transfusiones y de madre a hijo cuando las mujeres embarazadas se infectan durante el embarazo. El virus tiene un tropismo para los precursores eritropoyéticos en la médula ósea y en la sangre que causan lisis celular. Según la competencia inmunológica, puede provocar anemias más o menos graves. La infección por Parvovirus B19 es común y suele generar síntomas leves. Se sabe que es el agente causante de erupciones eritematosas (eritema infeccioso) en los niños, o síntomas más complicados como artropatía aguda o varias formas de artritis en adultos. Asimismo, en poblaciones más específicas, la infección por Parvovirus B19 puede provocar anemias graves, como anemia aplástica transitoria (TAC) en pacientes con trastornos hemolíticos preexistentes, insuficiencia crónica de médula ósea, y anemia en pacientes inmunodeprimidos o hidropesía fetal cuando se transmite al feto a través de la placenta. La infección durante el embarazo puede incluso provocar un aborto espontáneo. La detección de Parvovirus B19 IgG e IgM es especialmente adecuada para determinar el estado inmunológico de los pacientes de riesgo con cuadros clínicos inusitados y que podrían padecen una infección aguda o reciente, y más especialmente en mujeres embarazadas que evitan complicaciones graves para el feto en caso de sospecharse una infección de Parvovirus B19. 37

4 3- PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO Platelia Parvovirus B19 IgM es una prueba de tipo ELISA de µ-inmunocaptura para la detección de anticuerpos IgM producidos contra Parvovirus B19 (PVB19) en suero o plasma humano. El ensayo utiliza anticuerpos monoclonales IgM antihumanos de ratón fijados sobre una microplaca. Una vez añadida la muestra, todos los IgM de la muestra se unirán al IgM antihumano en los pocillos del ensayo. Después de una fase de lavado, se añade el antígeno recombinante viral producido por baculovirus y éste se une a los anticuerpos IgM específicos contra PVB19 solo cuando están presentes. El exceso se elimina después de la segunda fase de lavado, y los anticuerpos anti-pvb19 monoclonales de ratón marcados con peroxidasa se distribuyen y forman un complejo con el antígeno PVB19 capturado. Tras una fase de lavado final, el complejo se detecta añadiendo sustrato de tetrametilbencidina (TMB) que se vuelve de color azul en presencia de peroxidasa. La adición del reactivo que detiene la reacción genera un producto final amarillo estable. 38

5 4- REACTIVOS Los reactivos son suministrados en cantidad suficiente para realizar 96 determinaciones en un máximo de 6 series. Todos los reactivos están destinados a utilizarse únicamente en el diagnóstico in vitro. 1. Descripción Identificación de la etiqueta Descripción R1 Microplate Microplaca 12 x 8 pocillos fijados con anticuerpo monoclonal IgM antihumano de ratón R2 R3 Concentrated Solución de lavado concentrada (10x) Washing Tampón de fosfato con Tween 20 Solution (10x) Negative Control Control negativo Plasma humano negativo para IgM contra Parvovirus B19, Albúmina de suero bovino. Conservante: azida de sodio (0,08 w/v%) R4 Calibrator Calibrador del punto de corte Plasma humano positivo para IgM contra Parvovirus B19, Albúmina de suero bovino. Conservante: azida de sodio (0,08 w/v%) R5 Positive control Control positivo Plasma humano positivo para IgM contra Parvovirus B19, Albúmina de suero bovino. Conservante: azida de sodio (0,08 w/v%) R6a Antigen Antígeno viral (liofilizado) Antígeno recombinante B19 de parvovirus humano purificado R6b Conjugate Conjugado Anticuerpo monoclonal contra el parvovirus B19 antihumano de ratón marcado con peroxidasa, Albúmina de suero bovino. R7 Diluent Diluyente para muestras Tampón de fosfato, Albúmina de suero bovino. R9 R10 Chromogen TMB Stopping Solution Cromógeno tetrametilbencidina (< 0,02%), H 2O 2 (<1%) Solución de parada Solución de ácido sulfúrico 0,6 N Presentación /preparación 1 Lista para usar 1 x 100 ml Para diluir 1 x 2 ml Listo para usar 1 x 2 ml Listo para usar 1 x 2 ml Listo para usar 6 x 1 qs. 2 ml Para reconstituir 1 x 16 ml Listo para usar 4 x 60 ml Listo para usar 1 x 16 ml Listo para usar 1 x 16 ml Lista para usar 39

6 2. Requisitos para el almacenamiento y la manipulación El kit debe conservarse a +2-8 C. Cada elemento del kit conservado a +2-8 C antes de la apertura puede utilizarse hasta la fecha de caducidad indicada en el envase (excepto si se indica lo contrario en instrucciones específicas). Identificación R1 R2 R3, R4, R5 R7 R6a R6b R9, R10 Conservación En una bolsa cerrada, 4 semanas a +2-8 C (compruebe la presencia de secante). Antes de la dilución: hasta la fecha de caducidad que se indica en la etiqueta, a +2-8 C y sin contaminación. Después de la dilución: 24 h a +2-8 C Después de la apertura: hasta la fecha de caducidad que se indica en la etiqueta, a 2-8 C y sin contaminación. Después de la apertura: hasta la fecha de caducidad que se indica en la etiqueta, a 2-8 C y sin contaminación. Antes de la reconstitución: hasta la fecha de caducidad que se indica en la etiqueta, a 2-8 C. Después de la reconstitución: a utilizar en el plazo de 1 hora. Después de la apertura: hasta la fecha de caducidad que se indica en la etiqueta, a 2-8 C y sin contaminación. Después de la apertura: hasta la fecha de caducidad que se indica en la etiqueta, a 2-8 C y sin contaminación. 5- PRECAUCIONES DE USO Uso para diagnóstico in vitro. Para uso exclusivamente profesional Instrucciones de higiene y seguridad Utilizar bata de laboratorio y guantes de un solo uso y protección ocular para manipular reactivos y muestras. No pipetear con la boca. No comer, beber ni fumar durante la manipulación de las muestras y la prueba. Los controles negativo (R3) y positivo (R5) y el calibrador (R4) se fabrican a partir de plasma humano que ha sido sometido a ensayo y que no es reactivo a HBsAg y a los anticuerpos contra VIH-1, VIH-2 y VHC. Sin embargo, todos los reactivos deberán manipularse como si pudieran transmitir una infección. Todas las pruebas deberán realizares conforme a la norma de la OSHA sobre agentes patógenos de la sangre, nivel de bioseguridad 2 u otras prácticas de bioseguridad adecuadas.

7 Considerar el material que está directamente en contacto con las muestras y los reactivos de origen humano así como las soluciones de lavado, como productos contaminados. Evitar las salpicaduras de muestras o de soluciones que las contengan. Limpiar las superficies manchadas con lejía diluida al 10%. Si el líquido contaminante es un ácido, neutralizar previamente con bicarbonato sódico las superficies manchadas y a continuación limpiar con lejía diluida al 10%, etanol al 70%, o un 0,5% de Wescodyne Plus y secar con papel absorbente. El material utilizado para la limpieza deberá desecharse en un contenedor especial para desechos contaminados. Eliminar las muestras, los reactivos de origen humano y el material y los productos contaminados después de su descontaminación. - ya sea mediante inmersión en lejía a una concentración final de 5% de hipoclorito de sodio durante 30 minutos. - o bien mediante autoclave a 121 ºC durante al menos 20 minutos. No introducir en el autoclave soluciones que contengan hipoclorito de sodio. Cuidado: los controles y el calibrador que contienen azida de sodio pueden reaccionar con el plomo y el cobre de las tuberías formando depósitos de azidas de metal altamente explosivos; dilúyalos con grandes cantidades de agua para eliminarlos. La Hoja de datos de seguridad de materiales está disponible en 2. Precauciones relativas al procedimiento Preparación La calidad de los resultados depende del respeto de las siguientes Buenas Prácticas de Laboratorio: No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad. No mezclar, ni asociar durante una misma serie, reactivos procedentes de kits con números de lote diferentes. Procesamiento Guardar los reactivos en las condiciones recomendadas. No congelar los reactivos. Antes de utilizar, esperar 30 minutos a que los reactivos adquieran la temperatura ambiente ( C). Reconstituir o diluir minuciosamente los reactivos, evitando cualquier contaminación. Comprobar los controles y el calibrador en cada ejecución. 41

8 No realizar el test en presencia de vapores reactivos (ácidos, alcalinos, aldehídos) o de polvos que pudieran alterar la actividad enzimática del conjugado. Utilizar preferentemente material de un solo uso. En su defecto, utilizar artículos de cristal lavados y enjuagados con agua destilada. Comprobar que las muestras, la solución de antígeno viral o el conjugado no se adhieran a la pared de los pozos durante la distribución. El lavado de la microplaca es una etapa esencial de la manipulación. Respetar el número de ciclos de lavado prescrito y asegurarse de que todos los pocillos se rellenen perfectamente y luego se vacíen por completo. Un mal lavado puede provocar resultados incorrectos. No dejar secar la microplaca entre el final de los lavados y la distribución de los reactivos. No utilizar nunca el mismo recipiente para distribuir el conjugado y el cromógeno TMB. La reacción enzimática es muy sensible a todos los metales o iones metálicos. Por consiguiente, ningún elemento metálico debe entrar en contacto con las diferentes soluciones que contienen el conjugado o el cromógeno TMB. El cromógeno TMB (R9) debe ser incoloro o de color amarillo claro. La aparición de un color azul indica que el reactivo no es utilizable y debe reemplazarse. Ha transcurrido un cierto tiempo desde la parada de la reacción, y por lo tanto, pueden producirse precipitados negros en pocillos en los que se ha desarrollado un color fuerte. Utilizar un cono de distribución nuevo para cada muestra. Comprobar la exactitud de las pipetas y el correcto funcionamiento de los aparatos utilizados. 6- MUESTRAS Las pruebas se realizan sobre muestras de suero y plasma recogidas sobre anticoagulante de tipo EDTA, heparina o citrato. Respetar las instrucciones siguientes para la extracción, el tratamiento y la conservación de las muestras de sangre: Extraer una muestra de sangre siguiendo las prácticas en uso. Después de la centrifugación, extraer el suero o el plasma y conservarlo en tubo cerrado. Si no es para realizar pruebas en el plazo de 8 horas, el suero o plasma puede guardarse a 2-8 C un máximo de 7 días. Si las muestras no pueden someterse a ensayo en el plazo de 7 días, se congelarán de inmediato después de recibirlas a -20 C (o más frío). 42

9 Se recomienda no proceder a más de tres ciclos de congelación/ descongelación. Las muestras deberán homogeneizarse minuciosamente (vórtex) después de descongelar y antes de realizar la prueba. Las muestras diluidas no deben guardarse; si es necesario repetir una prueba, deberá utilizarse una nueva preparación. Las muestras que contengan 30 mg/dl de bilirrubina no conjugada, y las muestras hemolizadas que contienen hasta 500 mg/dl de hemoglobina no deben afectar a los resultados No calentar las muestras. 7- MATERIALES NECESARIOS 1. Materiales suministrados Consulte la sección 4, REACTIVOS 2. Materiales necesarios pero no suministrados Agitador tipo vórtex. Lector de microplacas equipado con filtros 450/620 nm (*). Agitador de microplacas. Sistema de lavado automático, semiautomático o manual para microplacas (*). Agua destilada o desionizada. Guantes de un solo uso. Gafas de protección. Papel absorbente. Pipetas o multipipetas, automáticas o semiautomáticas, ajustables o fijas, que pueden medir de 10 µl a µl, y 5 ml y 10 ml. Probetas graduadas de 25 ml, 50 ml, 100 ml y ml. Hipoclorito de sodio (lejía) y bicarbonato de sodio. Contenedor de desechos contaminados. Tubos de un solo uso. Tapa o película de plástico para la microplaca. (*) Para obtener una información más detallada sobre los aparatos validados por nuestros servicios técnicos, consúltenos. 43

10 8- INSTRUCCIONES DE USO Preparación de los reactivos R1: Esperar 30 minutos a que adquiera la temperatura ambiente ( C) antes de abrir la bolsa. Sacar el soporte. Volver a poner inmediatamente en la bolsa las tiras del soporte no utilizadas, comprobando que haya secante. Volver a cerrar minuciosamente la bolsa y poner de nuevo a +2-8 C. R2: Diluir a 1/10 la solución R2 con agua destilada: 100 ml de R2 en 900 ml de agua destilada. Se obtiene de este modo la solución lista para usar. Tener previstos 220 ml de solución de lavado diluida para una placa entera de 12 tiras en modo de lavado manual. R6a: Reconstituir la solución de antígeno viral añadiendo 2 ml de diluyente (R7) en el vial del antígeno viral (R6a). Todos los demás reactivos están listos para usar. 2. Preparación de la muestra Las pruebas se realizan sobre muestras de suero recogidas en tubos secos y plasma recogido sobre anticoagulante de tipo EDTA, heparina o citrato. Respetar las instrucciones siguientes para la extracción, el tratamiento y la conservación de las muestras de sangre: Extraer una muestra de suero siguiendo las prácticas en uso. Dejar que se forme el coágulo totalmente antes de centrifugar. Conservar los tubos cerrados. Después de la centrifugación, extraer el suero o el plasma y conservarlo en tubo cerrado. 3. Procedimiento Seguir al pie de la letra el protocolo propuesto y aplicar las Buenas Prácticas de Laboratorio. Antes de usar, esperar a que todos los reactivos se pongan a temperatura ambiente ( C). Utilizar todos los controles en cada dosificación para validar la calidad de la prueba y calcular el valor umbral. 1. Establecer cuidadosamente el plan de distribución y de identificación de los sueros de control y de las muestras de pacientes. 2. Preparar la Solución de Lavado diluida (R2) [Consultar el Capítulo 8.1]. 3. Sacar el soporte y las tiras (R1) del envase protector [Consultar el Capítulo 8.1]. 4. Todas las muestras, controles y calibrador deben someterse a agitación vorticial antes del uso. Diluir todas las muestras de la prueba a 1:201 (por ejemplo, añadiendo 10 µl de muestra y 2 ml de diluyente [R7]).

11 No diluir los controles y el calibrador. Homogeneizar minuciosamente las muestras diluidas. 5. Distribuir en cada pocillo 100 µl de control negativo (R3), calibrador (R4) en muestras duplicadas, de control positivo (R5) y diluidas, dejando un pocillo en blanco para el reactivo según el esquema siguiente: A Blanco S4 B R3 S5 C R4 S6 D R4 S7 E R5 S8 F S1 S9 G S2 S10 H S3 S11 6. Mezclar bien colocando la placa en un agitador para placas durante varios segundos. Cubrir la microplaca con una tapa o película de plástico para la microplaca. Incubar la microplaca durante 1 hora ± 5 minutos a temperatura ambiente (18 30 C). 7. Al final del periodo de incubación, retirar la tapa de la microplaca o la película de plástico, Aspirar el contenido de todos los pocillos en un contenedor para desechos contaminados (que contienen hipoclorito de sodio) Lavar la microplaca 3 veces con 200 µl por pocillo de la solución de lavado diluida (R2). Secar las tiras empapándolas en una hoja de papel absorbente y golpear ligeramente para eliminar la totalidad de la solución de lavado. 8. Preparar la Solución de antígeno viral [Consultar el Capítulo VIII.1]. 9. Distribuir inmediatamente 100 µl de la Solución de antígeno viral en todos los pocillos excepto en el pocillo en blanco. 10. Mezclar bien colocando la placa en un agitador para placas durante varios segundos. Cubrir la microplaca con una tapa o película de plástico para la microplaca. Incubar la microplaca durante 1 hora ± 5 minutos a temperatura ambiente (18 30 C). 11. Al final del periodo de incubación, retirar la tapa de la microplaca o la película de plástico, Aspirar el contenido de todos los pocillos en un contenedor para desechos contaminados (que contienen hipoclorito de sodio) Lavar la microplaca 3 veces con 200 µl por pocillo de la solución de lavado diluida (R2). Secar las tiras empapándolas en una hoja de papel absorbente y golpear ligeramente para eliminar la totalidad de la solución de lavado. 45

12 12. Distribuir inmediatamente 100 µl del conjugado (R6b) en todos los pocillos excepto en el pocillo en blanco. 13. Mezclar bien colocando la placa en un agitador para placas durante varios segundos. Cubrir la microplaca con una tapa o película de plástico para la microplaca. Incubar la microplaca durante 1 hora ± 5 minutos a temperatura ambiente (18 30 C). 14. Al final del periodo de incubación, retirar la tapa de la microplaca o la película de plástico, Aspirar el contenido de todos los pocillos en un contenedor para desechos contaminados (que contienen hipoclorito de sodio) Lavar la microplaca 5 veces con 200 µl por pocillo de la solución de lavado diluida (R2). Secar las tiras empapándolas en una hoja de papel absorbente y golpear ligeramente para eliminar la totalidad de la solución de lavado. 15. Distribuir inmediatamente, y protegido de luz fuerte, 200 µl del Cromógeno TMB (R9) en todos los pocillos, incluyendo el pocillo en blanco. Dejar la reacción desarrollarse en la oscuridad durante 30 ± 5 minutos a temperatura ambiente ( C). Cubrir la microplaca con una tapa o película de plástico para la microplaca. Durante esta incubación, no utilizar la película adhesiva. 16. Detener la reacción enzimática añadiendo 100 µl de la Solución de Parada (R10) en cada pocillo, incluyendo el pocillo en blanco. Adoptar la misma secuencia y el mismo ritmo de distribución que para la solución de revelado. 17. Secar minuciosamente la parte de abajo de las placas. Leer la densidad óptica a 450/620 nm con ayuda de un lector de placas en los 30 minutos que siguen a la parada de la reacción. Ajustar el cero de absorbancia del instrumento respecto al pocillo en blanco. Las tiras deben conservarse siempre protegidas de la luz antes de la lectura. 18. Asegurarse, antes de la trascripción de los resultados, de la concordancia entre la lectura y el plan de distribución de las placas y de las muestras. 9- CONTROL DE CALIDAD Todos los productos fabricados y comercializados por la sociedad Bio-Rad están bajo un sistema de garantía de calidad desde la recepción de materias primas hasta la comercialización de los productos acabados. Cada lote de producto acabado es objeto de un control de calidad y sólo se comercializa si cumple con los criterios de aceptación. La documentación relativa a la producción y al control de cada lote queda en manos del fabricante. 46

13 10- INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS En las siguientes secciones, DO es el valor de la densidad óptica para cada control, calibrador y muestra obtenidos a los que se restó la absorbancia del pocillo en blanco. 1. Cálculo del Valor Umbral (CVU) El CVU se calcula del siguiente modo: DO media (R4) El CVU se utiliza para la interpretación y el cálculo de la ratio de la muestra La ratio de la muestra (Ratio M.) es la DO del resultado de la muestra (DO. S) en comparación con el CVU: Ratio M.= DO S / CVU 2. Criterios de validación de la prueba Valores de la densidad óptica y la ratio: 0,100 DO R4 0,600 DO R3 / CVU < 0,600 DO R5 / CVU > 1,500 DO (R4 máx) / DO (R4 mín) < 2 Si estos criterios de validación no se cumplen, volver a empezar la manipulación. 3. Interpretación de los resultados La presencia o ausencia del anticuerpo IgM contra Parvovirus B19 en la muestra sometida a ensayo se determina comparando la densidad óptica de la muestra con el valor umbral. Ratio de muestra Ratio M. < 0,80 Resultado Negativo 0,80 Ratio M. < 1,00 Dudoso Ratio M. 1,00 Positivo Deberá prestarse una especial atención a los demás elementos de diagnóstico para los resultados que estén cerca de la zona gris. En caso de resultado dudoso, se recomienda poner a prueba una nueva muestra transcurridas 1-2 semanas. Pueden considerarse otros métodos y síntomas clínicos. Atención: muestras con DO<0 se consideran no interpretables y deben se retestadas NOTA: Es recomendable realizar las pruebas de detección de anticuerpos IgG e IgM al mismo tiempo para comprender mejor la fase de la infección. 47

14 Se supone que el paciente está libre de la infección por Parvovirus B19 humano cuando los dos resultados de IgG e IgM son negativos. Se supone que el paciente se ha infectado recientemente con Parvovirus B19 cuando el resultado de IgM es positivo independientemente del resultado de IgG. Se supone que el paciente ha padecido una infección por Parvovirus B19 cuando el resultado de IgG es positivo y resultado de IgM es negativo. 11- LIMITACIONES DE LA PRUEBA El diagnóstico de Parvovirus B19 no puede establecerse definitivamente más que en un conjunto de datos clínicos y biológicos. 1. El uso de Platelia Parvovirus B19 IgM se ha validado únicamente en muestras de suero y plasma humanos. 2. Una muestra en una fase temprana de la infección puede determinarse como negativa. 3. El ensayo Platelia Parvovirus B19 IgM debe considerarse una ayuda para el diagnóstico y se asocia con el historial clínico del paciente. 4. No es posible determinar si una infección es reciente o no en una sola muestra de sangre. Deberán someterse a ensayo dos muestras. 5. La desviación del procedimiento puede generar resultados anómalos. 12- CARACTERÍSTICAS DEL RENDIMIENTO 1. Precisión Repetibilidad Con el fin de evaluar la repetibilidad intra-análisis, una muestra negativa, una muestra débilmente positiva y una muestra positiva han sido testadas en 32 ocasiones, en una misma serie. Se calculó la ratio de la muestra para cada muestra. Resultados: En el cuadro siguiente se presentan las medias de las proporciones, la desviación estándar (DS) y el coeficiente de variación (%CV) para cada una de las tres muestras: N=32 Muestra negativa Muestra débilmente Muestra positiva positiva Media 0,20 1,71 4,91 DS 0,0111 0,0817 0,1147 %CV 5,6 4,8 2,3 48

15 Reproducibilidad Con el fin de evaluar la reproducibilidad inter-análisis se han testado una muestra negativa, una muestra débilmente positiva y una muestra positiva, cada una en duplicado y en dos series al día, durante un periodo total de 20 días. Se calculó la ratio de la muestra para cada muestra. En el cuadro siguiente se presentan las medias de las proporciones, la desviación estándar (DS) y el coeficiente de variación (%CV) para cada una de las tres muestras. N=80 Muestra negativa Muestra débilmente Muestra positiva positiva Media 0,18 1,85 5,49 DS 0,0134 0,1090 0,1796 %CV 7,5 5,9 3,3 2. Especificidad y sensibilidad relativas El rendimiento relativo de Platelia Parvovirus B19 IgM se evaluó en un total de 171 muestras clínicas que se caracterizaron primero utilizando un ensayo comercial de IgM. A continuación se ilustran los resultados de cada estudio: Platelia Parvovirus B19 IgM Assay Ensayo comercial de EIA Parvovirus B19 IgM Positivo Dudoso Negativo Total Positivo Dudoso Negativo Total El resultado dudoso obtenido en los dos ensayos se excluyó del cálculo. Se calcula que la concordancia total del ensayo Platelia Parvovirus B19 IgM con el ensayo EIA IgM de referencia es un 98,8%. Especificidad relativa La especificad relativa del ensayo Platelia Parvovirus B19 IgM se determinó comparativamente con los resultados negativos obtenidos con el ensayo comercial utilizado como referencia. Se calculó que era del 99,1% (95,2% - 100,0%). El único resultado positivo obtenido en el ensayo Platelia Parvovirus IgM en muestras caracterizadas negativas se obtuvo con un método EIA Parvovirus IgM alternativo y confirmado como positivo. 49

16 Sensibilidad relativa La sensibilidad relativa del ensayo Platelia Parvovirus B19 IgM se determinó comparativamente con los resultados positivos obtenidos con el ensayo comercial utilizado como referencia. Todas las muestras caracterizadas positivas se determinaron como positivas con Platelia Parvovirus B19 IgM para una sensibilidad relativa del 100,0% (93,3% - 100,0%). 3. Reactividad cruzada Un panel de 92 muestras, incluyendo 50 muestras positivas para toxoplasmosis, rubéola, VEB, HSV, VZV, paperas y 42 muestras positivas para el factor reumatoide, autoanticuerpos, anticuerpos heterófilos, y de pacientes con lupus eritematoso sistémico se sometió al ensayo Platelia Parvovirus B19 IgM y a un ensayo EIA Parvovirus B19 IgM comercial para la detección de anticuerpos IgM anti-parvovirus. Entre estas muestras, solo 2 resultaron positivas con Platelia Parvovirus B19 IgM: Un suero positivo para el factor reumatoide y dudoso con el test de referencia, Un suero positivo para los anticuerpos humanos antiratón y dudoso con el test de referencia, Los resultados se presentan en la siguiente tabla: Posible reactividad cruzada N Platelia Parvovirus B19 IgM Ensayo comercial EIA Parvovirus B19 IgM Negativo Dudoso Positivo Negativo Dudoso Positivo Factor reumatoide Anticuerpo antinuclear Anticuerpo humano antiratón Lupus sistémico IgM contra el virus Anti Epstein Barr IgM antirubéola IgM antipaperas IgM contra Varicella Zoster IgM contra CMV IgM contra HSV IgM contra Toxoplasmosis Total

17 4. Sustancia interferente La heparina anticoagulante, EDTA-2Na y el citrato de sodio no afectaron a la reacción a concentraciones de hasta 20 IU/ml, 1 mg/ml y 3 mg/ml respectivamente. La hemoglobina y bilirrubina no afectaron a la reacción en concentraciones de hasta 500 mg/ml y 30 mg/ml respectivamente. El factor reumatoide no afectó a la reacción en una concentración de hasta 360 IU/ml. 13- REFERENCIAS 1. Cossart, Y. E., Field, A. M., Cant, B. & Widdows, D. : Parvovirus-like particles in human sera. Lancet I : 72-73, Pattison, J. R., Jones, S. E., Hodgson, J., Davis, L.R., White, J. M., Stroud, C. E. & Murtaza, L. : Parvovirus infection and hypoplastic crisis in stckle cell anaemia. Lancet, I : 664, Maria Soderlund, Caroline S. Brown, Willy J. M. Spaan, Lea Hedman, and Klaus Hedman : Epitope Type-Specific IgG Responses to Capsid Proteins VP1 and VP2 of Human Parvovirus B19 4. Allyson R. Butchko and Jeanne A. Jordan : Comparison of Three Commercially Available Serologic Assays Used To Detect Human Parvovirus B19-Specific Immunoglobulin M(IgM) and IgG Antibodies in Sera of Pregnant Women 5. Elisabetta Manaresi, Giorgio Gallinella, et al. : Humoral Immune Response to Parvovirus B19 and Serological Diagnosis of B19 Infection 6. Caroline S. Brown, Marcel M.M. Salimans, et al. : Antigenic parvovirus B19 coat proteins VP1 and VP2 produced in large quantities in a baculovirus expression system 7. Marcel M.M. Salimans, Mario J.A.W.M. van Bussel, et al. : Recombinant parvovirus B19 capsids as a new substrate for detection of B19-^specific IgG and IgM antibodies by an enzyme-linked immunosorbent assay 8. C.H. Woernle, L.J. Anderson, P. Tattersall, and J.M. Davison : Human Parvovirus B19 Infection During Pregnancy 9. Elisabetta Manaresi, Elisa Zuffi, Giorgio Gallinella, et al. : Differential IgM Response to Conformational and Linear Epitopes of Parvovirus B19 VP1 and VP2 Structural Proteins 51

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