TOXOPLASMA IgG EIA WELL REF K1TG REF K1TGB. Español. M49.es Rev.13 07/2008

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1 0123 TOXOPLASMA IgG EIA WELL REF K1TG 96 REF K1TGB 192 Español M49.es Rev.13 07/2008

2 REACTIVOS DEL KIT REACTIVOS CANTIDAD ESTADO FÍSICO K1TG K1TGB MTP 1 x 96 2 x 192 Listo para usar WASH 1 x 50 ml 2 x 50 ml Concentrada DIL 1 x 20 ml 2 x 20 ml Concentrado NEG 1 x 2 ml 1 x 2 ml Listo para usar CAL 1 x 2.5 ml 4 x 1.5 ml 1 x 2.5 ml 4 x 1.5 ml Listo para usar CONJ 1 x 14 ml 2 x 14 ml Listo para usar TMB 2 x 15 ml 2 x 15 ml Listo para usar STOP 1 x 14 ml 2 x 14 ml Listo para usar M49.es Rev.13-07/2008 Pag. 2 /12

3 ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO PARA LA DETERMINACIÓN CUALITATIVA Y/O CUANTITATIVA DE LOS ANTICUERPOS IgG ANTI-TOXOPLASMA EN SUERO O PLASMA HUMANO PARA USO DIAGNÓSTICO IN VITRO 1. APLICACIONES CLÍNICAS El protozoo Toxoplasma gondii es un parásito endocelular que provoca infecciones tanto en el hombre como en los animales. Los huespedes primarios son los gatos, en el intestino de los cuales los protozoos pasan por el estadio sexual de su ciclo de vida. En el hombre la toxoplasmosis es una infección bastante común. La infección se debe principalmente al consumo de carne contaminada cruda o poco hecha, o al contacto con animales infectados, como los gatos. La mayor parte de las infecciones, tanto en los adultos como en los adolescentes, tiene un desarrollo subclínico o muy benigno, a menudo acompañado de linfoadenopatía y ocasionalmente de otros síntomas como fiebre, linfocitosis y mialgia. La corioretinitis es una manifestación bien conocida de la infección, pero puede también tratarse de una recaída retardada de una infección congénita. Las encefalitis debidas a Toxoplasmosis son comunes en pacientes afectados por el SIDA. Los sujetos más vulnerables a la infección por Toxoplasma gondii son los pacientes inmunodeprimidos y el feto, especialmente en el primer semestre del embarazo; durante este periodo en el cual el SNC está en fase de desarrollo, el curso de la enfermedad tiene generalmente un resultado negativo. Las infecciones congénitas son a menudo la causa de abortos, corioretinitis, calcificaciones intracerebrales, problemas psicomotores, hidrocefalia y microcefalia. El título de anticuerpos en la población adulta es variable, dependiendo de varios factores como la edad, área geográfica y método del ensayo. Por ejemplo está bien documentado que el porcentaje de sueros positivos entre los Esquimales es cero, mientras entre los Brasileños es el 72% de la población. La frecuencia de la enfermedad en la población joven de los Estados Unidos oscila entre el 10% y el 20% y entre el 35% y el 70% entre las personas de más edad. La incidencia anual de nuevas infecciones en la población adulta esta comprendida entre el %. 2. PRINCIPIO DEL MÉTODO El presente kit se basa en el método inmunoenzimático de captura (ELISA) y utiliza como marcador enzimático la peroxidasa. Durante la primera incubación los anticuerpos anti- Toxoplasma de clase IgG eventualmente presentes en el suero, se unen al antígeno Toxoplasma adherido a la superficie de los pocillos. El material que no se haya unido se elimina mediante lavado. En una sucesiva incubación se hacen reaccionar los anticuerpos anti-igg humanas, conjugados con peroxidasa, con el complejo ya formado entre el antígeno y el anticuerpo anti-toxoplasma. Tras un nuevo lavado se añade la tetrametilbencidina incolora (TMB) que, al reaccionar con la peroxidasa presente, produce un compuesto coloreado. La reacción de desarrollo de color se para añadiendo H 2 SO 4 y la intensidad del color, medida en un espectrofotómetro a 450 nm y a 405 nm, es directamente proporcional a la concentración de anticuerpos IgG anti-toxoplasma presentes en las muestras y calibradores. 3. REACTIVOS SUMINISTRADOS CON EL KIT: PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD Los reactivos son suficientes para 96 pocillos (REF K1TG) o para 192 pocillos (REF K1TGB). El kit debe conservarse a 2-8 C. La fecha de caducidad de cada reactivo está indicada en su etiqueta. M49.es Rev.13-07/2008 Pag. 3 /12

4 Una vez abierto el kit es estable 2 meses a 2-8 C. 3.1 Reactivos específicos MTP CAL CONJ Microplaca sensibilizada: 1 o 2 microplacas de 96 pocillos/cada uno, divisibles individualmente, sensibilizados con el antígeno Toxoplasma purificado e inactivado. Los pocillos no utilizados deben conservarse a 2-8 C en la bolsa de plástico suministrada, cerrada herméticamente. Calibradores: IgG anti-toxoplasma en matriz sérica a las siguientes concentraciones: 15, 30, 60, 120 y 240 IU/mL. Conservante: NaN 3 (<0,1%). Listos para usar y coloreados de rojo, excepto el 15 IU/mL coloreado de azul. Los calibradores se han tarado ante el 2º I.S. (SSI), Conjugado Enzimático: anticuerpos monoclonales (ratón) anti-igg humanas, conjugados con peroxidasa de rábano (HRPO) en matriz sérica y estabilizantes. Conservante: Neomicina. Listo para usar y coloreado de rosa. 3.2 Reactivos Comunes para los kits de la Línea To.R.C.H. E.T.S. y Enfermedades de la infancia. WASH DIL NEG TMB STOP CPA Solución de Lavado (concentrada): PBS-Tween 20. Conservante: Mertiolato (<0.05%). En el momento del uso diluir la cantidad necesaria 1:20 con H 2 O destilada. Si se observan cristales insolubles, resuspénderlos poniendo el vial a 37 C durante algunos minutos. Tras la dilución el tampón de lavado es estable 30 días a 2-8 C. Diluyente de las Muestras (concentrado): matriz sérica y estabilizantes, coloreado de rojo. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Antes de usarla diluir 1:20 con la solución de lavado ya diluida. Tras la dilución el diluyente es estable 30 días a 2-8 C. Control Negativo: matriz sérica no reactiva ante las IgG anti-toxoplasma. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Listo para usar y coloreado de rojo. El suero de control negativo debe utilizarse como: 1) control en el ensayo cualitativo, y 2) punto de concentración 0 IU/mL en el ensayo cuantitativo. Cromógeno: Tetrametilbencidina (TMB) en tampón de citrato-fosfato, DMSO y H 2 O 2. Listo para usar. Reactivo de Parada: H 2 SO 4 1N. Listo para usar. Cubreplaca adhesivo. Bolsa de plástico con cierre. 4. MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO 4.1 Ensayo manual Micropipetas automáticas con puntas desechables de volumen variable. Incubador a 37±2 C. Cilindros graduados para la dilución de los reactivos. Bomba de aspiración o instrumento automático de lavado de microplaca. Espectrofotómetro de precisión para microplacas, capaz de medir la absorbancia en el intervalo A con una longitud de onda de 450 y 405 nm. Papel milimetrado. H 2 O destilada. M49.es Rev.13-07/2008 Pag. 4 /12

5 4.2 Ensayo automático El kit puede utilizarse con instrumentación automática para kits ELISA en microplaca. Se garantiza la aplicabilidad en instrumentación RADIM y/o SEAC. En el caso se utilice instrumentación automática de otros fabricantes, es responsabilidad del usuario asegurarse de que el kit haya sido oportunamente validado. 5. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Para conseguir resultados correctos y reproducibles, deberán observarse las siguientes normas: No mezclar los reactivos específicos (vea 3.1) de lotes diferentes. Es posible utilizar reactivos comunes (vea 3.2) de lotes diferentes. No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad. No exponer los reactivos y las muestras al calor intenso ni a fuentes importantes de contaminación. Utilizar material de vidrio perfectamente limpio y libre de contaminación por iones metálicos o sustancias oxidantes. Utilizar agua destilada o desionizada, conservada en recipientes perfectamente limpios. Evitar cuidadosamente la contaminación entre muestras; para ello es aconsejable utilizar pipetas con puntas desechables para cada muestra y reactivo. No modificar el Procedimiento Operativo de ejecución del ensayo. Eventuales alteraciones de: secuencia y cantidades al añadir los reactivos tiempos y temperatura de incubación pueden dar lugar a resultados clínicos erróneos. Reconstituir los reactivos liofilizados según la modalidad descrita en la etiqueta; la utilización de reactivos o volúmenes no adecuados puede provocar la obtención de datos clínicos incorrectos. En el caso de procedimiento manual es importante utilizar pipetas calibradas y tener una adecuada manualidad técnica. En particular es importante la precisión en la preparación y dispensación de los reactivos. Es necesario un adecuado mantenimiento (limpieza y calibración) de tales instrumentos. Asegurarse de que la bomba de aspiración o el sistema automático para el lavado de las microplacas funcione correctamente. El lavado inadecuado de las microplacas puede causar la clasificación incorrecta de las muestras. Es necesario un mantenimiento adecuado de tales sistemas. Asegurarse de que el espectrofotómetro funcione perfectamente. El uso de un espectrofotómetro no calibrado o con filtros no limpios puede causar una lectura errónea de las muestras, con consiguiente error en su clasificación. Es necesario un adecuado mantenimiento (limpieza y calibración) de tales instrumentos. Asegurarse de que el incubador (si es necesario) funcione perfectamente. La incubación a temperaturas distintas a los 37±2º puede causar una pérdida de sensibilidad y/o desnaturación biológica de los materiales (muestras y/o reactivos). Es necesario un adecuado mantenimiento de tales instrumentos y un control periódico de la temperatura registrada. Asegurarse de que el agitador de microplacas (si es necesario) funcione perfectamente. La agitación incorrecta puede causar la clasificación errónea de las muestras. Es necesario un adecuado mantenimiento de tales instrumentos. Asegurarse de que los sistemas utilizados para la conservación de las muestras y/o el dispositivo funcione perfectamente. La conservación a temperaturas diferentes de la indicada puede causar la desnaturación biológica de los materiales (muestras y/o M49.es Rev.13-07/2008 Pag. 5 /12

6 reactivos). Es necesario un adecuado mantenimiento de tales sistemas y un control periódico de la temperatura registrada. Utilizar un método adecuado para la correcta identificación de las muestras de los pacientes. Una identificación incorrecta puede provocar pérdida de la especificidad del sistema y resultados clínicos erróneos. Para evitar contaminaciones personales y ambientales, deberán observarse las siguientes normas de seguridad: Utilizar guantes desechables durante la manipulación del material potencialmente infeccioso y durante el ensayo. No pipetear los reactivos con la boca. No fumar, comer, beber o aplicar cosméticos durante la ejecución del ensayo. Las soluciones de Cromógeno y el Reactivo de Parada deben manipularse con cuidado. Evitar el contacto con la piel, los ojos y las mucosas. En caso de contaco lavar con abundante agua. Todos los materiales humanos suministrados con el kit han sido sometidos a análisis resultando negativos a la presencia de HBsAg, anti-hiv y anti-hcv. Sin embargo, los ensayos mencionados no garantizan la total ausencia de los agentes vírales responsables del síndrome de inmunodeficiencia adquirida y de la hepatitis B y C. Por eso todos los reactivos contenentes material biológico y todas las muestras deben considerarse potencialmente infecciosos. Evitar salpicaduras y formación de aerosoles; en caso de que se presenten, limpiar cuidadosamente con hipoclorito sódico a una concentración final de 3%. Todo el material utilizado para la limpieza debe tratarse como residuo potencialmente infeccioso y desecharse según las oportunas modalidades. La azida sódica, contenida como conservante en algunos reactivos, puede reaccionar con el plomo y el cobre de los desagües formando azidas metálicas altamente explosivas. Para evitar la formación y la acumulación de dichos compuestos deje correr abundantemente el agua al eliminar los reactivos. Los reactivos para los que no se suministra la ficha de seguridad no contienen sustancias químicas peligrosas o, si las contienen, están por debajo de los límites de concentración definidos en el D.Lgs.285/98 conforme a la directiva CEE 91/155. Conforme al Decreto Italiano D.L. no. 22, del y conforme a las directivas de la CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE), todos los desechos originados por procesos manuales y/o automáticos se clasifican como material de deshecho peligroso, código de Clasificación CER : como tales, deben eliminarse delegando su recolección y desecho a empresas especiales autorizadas para ello. 6. RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS El ensayo puede realizarse en muestras de suero o plasma humanos. Las muestras moderadamente lipémicas no afectan los resultados; las muestras extremadamente lipémicas o hemolizadas pueden alterar los resultados. La presencia de filamentos de fibrina podría interferir en el ensayo; asegurarse por lo tanto de que las muestras estén perfectamente limpias antes de ensayarlas. Las muestras pueden conservarse a 2-8 C durante 1 semana; para períodos más largos se recomienda conservar las muestras a - 20 C. Se aconseja no congelar y descongelar repetidamente las muestras. Antes de su uso, diluir las muestras 1:300 con el diluyente de las muestras ya preparado (ejemplo: 10 µl de muestra µl de diluyente). 7. PROCEDIMIENTO OPERATIVO Esperar que los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente. M49.es Rev.13-07/2008 Pag. 6 /12

7 Agitar las muestras por inversión antes de utilizarlas. 7.1 Preparar los pocillos para el Blanco, el Suero de Control o Calibradores y las muestras. 7.2 Dispensar 100 µl de Suero de Control o Calibradores y muestras ya diluidas en los respectivos pocillos. Nota: el Suero de Control y los Calibradores no deben diluirse. 7.3 Dispensar 100 µl de Diluyente de las Muestras diluido en el pocillo del blanco. 7.4 Incubar durante 60±5 minutos a 37±2 C cubriendo la microplaca con la hoja adhesiva suministrada con el kit. 7.5 Lavar los pocillos 4 veces con 350 µl (por pocillo) de Solución de Lavado diluida. Aspirar completamente el líquido de todos los pocillos. 7.6 Dispensar 100 µl de Conjugado Enzimático en todos los pocillos. 7.7 Incubar durante 30±2 minutos a 37±2 C cubriendo la microplaca con la hoja adhesiva suministrada con el kit. 7.8 Lavar los pocillos como en el punto Dispensar 100 µl de Cromógeno en todos los pocillos Incubar durante 10 minutos a 37±2 C o 15 minutos a temperatura ambiente (18-25 C) al resguardo de la luz Dispensar 100 µl de Reactivo de Parada en todos los pocillos Leer la densidad óptica a 450 nm, preferiblemente en un espectrofotómetro bicromático con longitud de onda de referencia de 620 nm (haciendo el cero del instrumento con el blanco). En el caso de lectura fuera del rango (overflow), leer a 405 nm. Leer en los primeros 15 minutos después de terminar el ensayo. *En caso de que se utilice en el procedimiento un sistema automático RADIM y/o SEAC para microplacas, ver el manual correspondiente. 8. ESQUEMA DEL ENSAYO: Ver pág CÁLCULO DE LOS RESULTADOS * 9.1 Ensayo cualitativo Considerar la densidad óptica de cada control negativo y calibrador Cut-off (15 IU/mL: Valor umbral). Comparando la densidad óptica de las muestras con la densidad óptica del calibrador Cut-off se determina la reactividad o no reactividad ante los anticuerpos IgG anti- Toxoplasma gondii. Las muestras con valores de densidad óptica inferiores al valor del calibrador 15 IU/mL (calibrador Cut-off) deben considerarse no reactivas ante los anticuerpos IgG anti- Toxoplasma. Las muestras con valores de densidad óptica superiores al valor del calibrador Cut-off deben considerarse reactivas ante los anticuerpos IgG anti-toxoplasma. Las muestras con valores de densidad óptica comprendidos en el intervalo de ± 10% del calibrador Cut-off, deben considerarse de interpretación dudosas y deben volverse a ensayar. 9.2 Ensayo cuantitativo El control negativo debe considerase como el primer punto de la curva de calibración con un valor de 0 IU/ml de IgG anti-toxoplasma y por lo tanto hace parte de la misma curva. Dibujar la curva en un papel milimetrado, poniendo en el eje de las abscisas las concentraciones de los calibradores y en el de las ordenadas la absorbancia obtenida para cada calibrador. Interpolando sobre la curva de calibración las absorbancias relativas a cada muestra se obtendrán las correspondientes concentraciones de IgG anti-toxoplasma en IU/mL. - Muestras con valores de IgG inferiores a 15 IU/mL deben considerarse no reactivas ante los anticuerpos IgG anti-toxoplasma. M49.es Rev.13-07/2008 Pag. 7 /12

8 - Muestras con valores de IgG comprendidos entre 15 IU/mL y 30 IU/ml deben considerarse débilmente reactivas. - Muestras con valores de IgG superiores a 30 IU/mL deben considerarse reactivas ante los anticuerpos IgG anti-toxoplasma. * En el caso de que se utilice el sistema automático RADIM y/o SEAC para microplacas, la lectura espectrofotométrica se realiza automáticamente con 3 longitudes de onda: 450, 405 y 620 nm, permitiendo la ampliación del rango de lectura. 9.3 Ejemplo de cálculo Los valores siguientes deben considerarse únicamente como un ejemplo y no deben emplearse en lugar de los datos experimentales. Descripción Absorbancia 450 nm IgG anti- Toxoplasma Absorbancia 405 nm Calibrador 0 IU/mL Calibrador 15 IU/mL Calibrador 30 IU/mL Calibrador 60 IU/mL Calibrador 120 IU/mL Calibrador 240 IU/mL Muestra IU/mL Nota: Control Negativo = Calibrador 0 IU/mL. Interpolando sobre la curva de calibración, la muestra ensayada presenta como resultado un título de IgG anti-toxoplasma de 85 IU/mL. 9.4 Criterios de aceptación Antes de proceder al cálculo de los resultados, verificar que las absorbancias de los controles respeten los siguientes valores: Descripción Valor esperado Control Negativo < DO Cal 240 IU/mL / DO Cal 15 IU/mL > 6.08 DO Cal 15 IU/mL / DO Cal 0 IU/mL > 7.16 Si los valores obtenidos no son los esperados, será necesario repetir el ensayo. 9.5 Interpretación de los resultados Las muestras no reactivas deben considerarse negativas antes los anticuerpos IgG anti- Toxoplasma. Las muestras reactivas y/o débilmente reactivas deben considerarse positivas ante los anticuerpos IgG anti-toxoplasma. Extracciones sucesivas de un mismo paciente pueden compararse entre ellas sólo si se procesan en el mismo ensayo; en este caso un aumento del 60% en la densidad óptica de la segunda muestra puede considerarse indicativo de una infección reciente o en curso. En tal caso se aconseja ensayar las IgM específicas. 10. CARACTERÍSTICAS METODOLÓGICAS 10.1 Especificidad diagnóstica M49.es Rev.13-07/2008 Pag. 8 /12

9 La especificidad diagnóstica del método se ha evaluado en un grupo de más de 500 muestras no inmunes a infecciones por Toxoplasma, resultando igual al 99.1% Sensibilidad diagnóstica La sensibilidad diagnóstica del método se ha evaluado en un grupo de más de 200 muestras con infección pregresa por Toxoplasma, resultando igual al 97.1% Especificidad analítica La especificidad analítica se define como la capacidad del ensayo de detectar con precisión el analito en presencia de factores potencialmente interferentes en la matriz de la muestra. Estudios controlados sobre factores potencialmente interferentes han demostrado que las prestaciones del ensayo no se influencian por anticoagulantes (EDTA y heparina) Sensibilidad analítica La sensibilidad analítica puede expresarse también como el límite de detección, o sea la cantidad mínima de analito detectable por el ensayo. El límite de detección es 0.6 miu/ml al 99% de confianza y se ha calculado como la concentración de analito distinguible del calibrador cero, es decir tres desviaciones estándar (SD) sobre el cero Precisión La precisión se ha evaluado en instrumentación Radim midiendo la repetitividad y la reproducibilidad (variabilidad intra-ensayo e inter-ensayo) en 3 sueros con distintas concentraciones de IgG anti-toxoplasma. Repetitividad (intra-ensayo) Suero Media ± D.E. C.V. No. de Replicados (IU/mL) % a 15.8 ± b 25.0 ± c ± Reproducibilidad (inter-ensayo) Suero Media ± D.E. C.V. No. de Ensayos (IU/mL) % a ± b ± c ± LÍMITES DEL ENSAYO Debe tenerse en cuenta que, para definir el estado inmunitario de un paciente ante el Toxoplasma gondii, la presencia de anticuerpos de tipo IgG a cualquier nivel no excluye la posibilidad de una infección en curso, mientras que el ensayo de los anticuerpos específicos de tipo IgM es de importancia fundamental para el diagnóstico precoz de la infección aguda. En caso de enfermedad, una intervención rápida permite reducir considerablemente los riesgos consiguientes. Sin embargo, los resultados del ensayo deben interpretarse con cautela y convalidarse con evaluaciones clínicas y ulteriores pruebas diagnósticas. 12. LEYENDA SÍMBOLOS: Ver pág. 10 M49.es Rev.13-07/2008 Pag. 9 /12

10 SÍMBOLOS EN 980 EDMA REF Código de referencia o número de pedido LOT Lote Fecha de caducidad IVD Para uso diagnóstico in vitro Marcado CE según directiva de IVD 98/79 CE Conservar a 2-8 C Producido por Riesgo biológico Consultar las instrucciones de uso Suficiente para determinaciones RDATE Fecha de referencia RCNS Reconstituir con H 2 O Agua destilada o desionizada M49.es Rev.13-07/2008 Pag. 10 /12

11 BIBLIOGRAFÍA 1 - Remington J.S. (1974). Toxoplasmosis in the adult. Bull N.Y. Acad. Med. 50, Vilaseca J. et al. (1982). Kaposi's sarcoma and T. gondii brain abscess in Spanish homosexual. Lancet No. 8271, Vol. 1, Feldman H.A. (1982). Epidemiology of Toxoplasma infections. Epidem. Rev., 4, Milatavic D., Braveny I. (1980). Enzyme-liked immunosorbent assay for the serodiagnosis of toxoplasmosis. J. Clin. Pathol. Vol. 33, Van Loon Am A., Van der Veen (1980). Enzyme-linked Immunosorbentassay for quantitation of toxoplasma antibodies in human sera. J. Clin. Pathol. Vol.33, 635- M49.es Rev.13-07/2008 Pag. 11 /12

12 ESQUEMA DEL ENSAYO Predilución de la muestra: 1/300 Pocillos Blanco NEG CAL Muestras Reactivos NEG µl CAL µl Muestras µl DIL 100 µl Incubar a 37±2 C, 60±5 min. Aspirar y Lavar: 4 x 350 µl. CONJ 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Incubar a 37±2 C, 30±2 min. Aspirar y Lavar: 4 x 350 µl. TMB 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Incubar a 37±2 C, 10' o a T.A. 15' STOP 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Leer a nm. RADIM S.p.A. - Via del Mare, Pomezia (Roma) Italia Tel.: Fax: National Order Entry: Export Department: Customer Care: info@radim.com -