PLATELIA TOXO IgM PRUEBAS

Transcripción

1 PLATELIA TOXO IgM PRUEBAS DETECCIÓN CUALITATIVA DE ANTICUERPOS IgM ANTI-TOXOPLASMA GONDII, EN SUERO O PLASMA HUMANO, POR MÉTODO INMUNOENZIMÁTICO

2 1. CAMPO DE APLICACIÓN Platelia Toxo IgM es una prueba inmunoenzimática por inmunocaptura para la detección cualitativa de anticuerpos IgM dirigidos contra T. gondii en suero o plasma humano. 2. INTERÉS CLÍNICO T. gondii es un protozoario capaz de infectar a numerosas especies de mamíferos y pájaros. Estas infecciones, habituales en el hombre y en los animales, se desarrollan generalmente de forma inapreciable desde el punto de vista clínico. La prevalencia de esta infección en la población, detectada por la presencia de anticuerpos específicos en el suero, varía en función de la región y de la edad. En caso de una primoinfección de la madre durante el embarazo, esta infección puede provocar graves secuelas en el feto (en especial, una alteración de las funciones cerebrales) o un aborto. La inmunidad antigua de la madre, demostrada mediante la presencia de anticuerpos IgG al inicio del embarazo, protege al feto de la infección por este parásito. La segunda población sensible a esta infección está representada por lospacientes inmunodeprimidos, como los enfermos afectados de SIDA. Estas infecciones se deben, casi exclusivamente, a una infección a partir de un foco parasitario (quiste) quiescente del paciente, cuya existencia es previa a la infección por el virus HIV. El diagnóstico de la infección toxoplásmica se confirma con la demostración de la presencia del parásito, pero su búsqueda mediante el examen directo es difícil, por no decir aleatorio. La serología representa la base del diagnóstico y del seguimiento de la toxoplasmosis. La presencia de anticuerpos específicos permite confirmar una contaminación por T. gondii; el estudio combinado de los anticuerpos pertenecientes a diferentes isotipos permite, generalmente, fechar la infección y orientar la terapéutica en caso de infección reciente, o establecer medidas profilácticas adecuadas al riesgo de aparición de una toxoplasmosis: medidas higiénico-dietéticas en mujeres embarazadas que no presenten anticuerpos, quimiofilaxia en los sujetos inmunodeprimidos seropositivos para T. gondii. 34

3 3. PRINCIPIO Platelia Toxo IgM es una prueba que permite la detección cualitativa de los anticuerpos IgM anti-t. gondii en suero o plasma humano mediante un método inmunoenzimático por inmunocaptura de las IgM en fase sólida. Se utilizan anticuerpos anti-cadena µ humana para sensibilizar la microplaca. Se utiliza como conjugado una mezcla de antígeno T. gondii y anticuerpo monoclonal anti-antígeno T. gondii marcado con peroxidasa. La aplicación de la prueba consta de las etapas siguientes: Etapa 1 Las muestras a estudiar y los controles se diluyen en proporción 1/21 y se depositan en los pocillos de la microplaca. Durante la incubación de 1 hora a 37ºC, las IgM son captadas por los anticuerpos anti-µ fijados a las cúpulas de los pocillos de la microplaca. Las IgG y el resto de las proteínas séricas son eliminadas mediante lavados al final de la incubación. Etapa 2 Se coloca el conjugado (mezcla de antígeno T. gondii y de anticuerpo anti- T. gondii marcado con la peroxidasa) en todos los pocillos de la microplaca. Durante esta incubación de 1 hora a 37 C, si la muestra probada contiene anticuerpos IgM específicos de T. gondii, éstos se fijarán al conjugado. El conjugado sobrante que no se une es eliminado mediante lavados al final de la incubación. Etapa 3 La presencia de los complejos inmunes (anti-cadena µ humana / IgM anti- T. gondii / Antígeno T. gondii / Anticuerpo monoclonal anti-t. gondii marcado con peroxidasa) que se forman eventualmente es revelada mediante la adición de una solución enzimática de revelado en cada pocillo. Etapa 4 Tras incubación a temperatura ambiente (+18-30ºC) la reacción enzimática se detiene mediante la adición de una solución de ácido sulfúrico 1N. La densidad óptica leída a 450/620 nm, interpretada en relación con un valor umbral, permite confirmar o informar de la presencia de IgM anti-t. gondii en la muestra probada. 35

4 4. COMPOSICIÓN DEL KIT Los reactivos son suministrados en cantidad suficiente para realizar 96 determinaciones. Todos los reactivos están destinados para utilizarse únicamente en el diagnóstico in vitro. Etiquetado Naturaleza de los reactivos Presentación R1 Microplate Microplaca : (lista para usar) : 12 tiras de 8 pocillos separables, sensibilizadas con anticuerpos anti-cadenas µ humanas 1 R2 R3 Concentrated Washing Solution (20x) Negative Control Solución de lavado (20x) : Tampón TRIS-NaCl (ph 7,4), 2% Tween 20. Conservante: < 1,5% ProClin 300 Control Negativo : Suero humano negativo a IgM anti-t. gondii, a antígeno HBs y a anticuerpos anti-vih1, anti-vih2 y anti-vhc Conservante: < 1,5% ProClin 300 R4 Calibrator Calibrador : Suero humano reactivo a las IgM anti-t. gondii, y negativo al antígeno HBs y a anticuerpos anti-vih1, anti-vih2 y anti-vhc Conservante: <1,5% ProClin 300 R5 Positive Control Control Positivo : Suero humano reactivo a las IgM anti-t. gondii, y negativo al antígeno HBs y a anticuerpos anti-vih1, anti-vih2 y anti-vhc Conservante: < 1,5% ProClin 300 R6a Antigen Antígeno T. gondii : Antígeno T. gondii liofilizado R6b Conjugate (101x) Conjugado (101 x) : Anticuerpo murino monoclonal, anti-t. gondii, acoplado a la peroxidasa Conservante: < 1,5% ProClin 300 R7 Diluent Diluyente para muestras y conjugado : (listo para usar) : Tampón TRIS-NaCl (ph 7,7), albúmina de suero bovino, Tween 20 al 0,1% y rojo fenol. Conservante: < 1,5% ProClin x 70 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 2 x qsp 14 ml 1 x 0,4 ml 1 x 80 ml 36

5 Etiquetado Naturaleza de los reactivos Presentación R9 Chromogen TMB Cromógeno (listo para usar): 3,3,5,5 tetrametilbencidina (< 0,1%), H 2 O 2 (<1%) 1 x 28 ml R10 Stopping Solution Solución de parada (lista para el uso): Solución de ácido sulfúrico 1N 1 x 28 ml Películas adhesivas 4 Consultar las indicaciones que aparecen en la caja para conocer las condiciones de conservación y la fecha de caducidad de los reactivos. 5. PRECAUCIONES DE USO La calidad de los resultados depende del respeto de las siguientes Buenas Prácticas de Laboratorio: No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad. No mezclar, ni asociar durante una misma serie, reactivos procedentes de kits con números de lote diferentes. OBSERVACIÓN: Es posible utilizar otros lotes de solución de lavado (R2 identificado 20x en color verde), de cromógeno (R9 identificado TMB en color turquesa) y de solución de parada (R10 identificado 1N en color rojo) que los que se suministran en el kit, a condición de utilizar reactivos estrictamente equivalentes de un mismo y único lote en el transcurso de una misma serie. OBSERVACIÓN: Además, la Solución de Lavado (R2, identificación en la etiqueta: 20X color verde) se puede mezclar con las otras 2 soluciones de lavado incluidas en los distintos kits de reactivos de Bio-Rad (R2, identificaciones en la etiqueta : 10X color azul o 10X color naranja) cuando se reconstituyen debidamente, siempre que se use sólo una mezcla en cada tanda de pruebas. Antes de utilizar, esperar 15 minutos a que los reactivos adquieran la temperatura ambiente ( C). Reconstituir o diluir minuciosamente los reactivos, evitando cualquier contaminación. No realizar la prueba en presencia de vapores reactivos (ácidos, alcalinos, aldehídos) o de polvos que pudieran alterar la actividad enzimática del conjugado. Utilizar preferentemente material de un solo uso. En su defecto, utilizar artículos de cristal lavados y enjuagados con agua destilada. El lavado de las microplacas es una etapa esencial de la manipulación: respetar el número de ciclos de lavado prescrito y asegurarse de que todas 37

6 las microplacas se rellenan perfectamente y luego se vacían por completo. Un mal lavado puede provocar resultados incorrectos. No dejar secar la microplaca entre el final de los lavados y la distribución de los reactivos. No utilizar nunca el mismo recipiente para distribuir el conjugado y la solución reveladora. La reacción enzimática es muy sensible a todos los metales o iones metálicos. Por consiguiente, ningún elemento metálico debe entrar en contacto con las diferentes soluciones que contienen el conjugado o el cromógeno. El cromógeno (R9) debe ser incoloro. La aparición de un color azul indica que el reactivo no es utilizable y debe reemplazarse. Utilizar un cono de distribución nuevo para cada muestra. Comprobar la exactitud de las pipetas y el correcto funcionamiento de los aparatos utilizados. INSTRUCCIONES DE HIGIENE Y SEGURIDAD Los componentes de origen humano que se utilizan en la preparación de los reactivos se han sometido a tests y han resultado no reactivos para el antígeno de superficie de la hepatitis B (Ag HBs), los anticuerpos dirigidos contra el virus de la hepatitis C (anti-vhc) y los anticuerpos dirigidos contra los virus de la inmunodeficiencia humana (anti-vih1 y anti-vih2). Dado que ningún método es capaz de garantizar de manera absoluta la ausencia de agentes infecciosos, ha que considerar los reactivos de origen humano y las muestras de los pacientes como potencialmente infecciosos y manipularlos con las precauciones habituales: Considerar el material que está directamente en contacto con las muestras y los reactivos de origen humano así como las soluciones de lavado, como productos contaminados. Utilizar guantes de un solo uso para manipular reactivos y muestras. No pipetear con la boca. Evitar las salpicaduras de muestras o de soluciones que las contengan. Limpiar las superficies manchadas con lejía diluida al 10%. Si el líquido contaminante es un ácido, neutralizar previamente con bicarbonato sódico las superficies manchadas y a continuación limpiar con lejía y secar con papel absorbente. El material utilizado para la limpieza deberá desecharse en un contenedor especial para desechos contaminados. Eliminar las muestras, los reactivos de origen humano y el material y los productos contaminados después de su descontaminación: - ya sea mediante inmersión en lejía a una concentración final de 5% de hipoclorito de sodio durante 30 minutos. - o bien mediante autoclave a 121ºC durante al menos 2 horas. 38

7 CUIDADO: no introducir en el autoclave soluciones que contengan hipoclorito de sodio Evitar todo contacto de los reactivos, incluidos los considerados como no peligrosos, con la piel y las mucosas. La manipulación y la eliminación de desechos químicos y biológicos deben hacerse siguiendo las Buenas Prácticas de Laboratorio. Todos los reactivos del kit están destinados a un solo uso diagnóstico in vitro. Cuidado: ciertos reactivos contienen ProClin 300 < 1,5% R43: Puede provocar una sensibilización por contacto con la piel. S28-37: Después del contacto con la piel, lavarse de inmediato y Xi - Irritante abundantemente con agua y jabón. Utilizar guantes adecuados. 6. MUESTRAS 1. Las pruebas se realizan sobre muestras de suero o de plasma recogido sobre anticoagulante de tipo EDTA, heparina o citrato. 2. Respetar las instrucciones siguientes para la extracción, el tratamiento y la conservación de las muestras de sangre: Extraer una muestra de sangre siguiendo las prácticas en uso. Para los sueros, dejar que se forme el coágulo totalmente antes de centrifugar. Conservar los tubos cerrados. Después de la centrifugación, extraer el suero o el plasma y conservarlo en tubo cerrado. Si la prueba se realiza en el plazo de 7 días, las muestras se conservarán a +2-8 C. Si la prueba no se realiza en el plazo de 7 días, o para cualquier envío, las muestras se congelarán a -20 C (o más frío). Se recomienda no proceder a más de 3 ciclos de congelación/ descongelación. Las muestras deberán homogeneizarse minuciosamente (vórtex) después de descongelar y antes de realizar la prueba. 3. Los resultados no se ven afectados por muestras que contengan 90 g/l de albúmina o 100 mg/l de bilirrubina no conjugada, las muestras lipémicas que contengan el equivalente de 36 g/l de trioleína (triglicérido) o muestras hemolizadas que contengan 10 g/l de hemoglobina. 4. No calentar las muestras. 7. MODO DE ACTUACIÓN 7.1 Material necesario no suministrado Agitador tipo vórtex. Lector de microplacas equipado con filtros 450/620 nm (*). Incubador de microplacas que admite termostato a 37 C ± 1 C (*). 39

8 40 Sistema de lavado automático, semiautomático o manual para microplacas (*). Agua destilada o desionizada estéril. Guantes de un solo uso. Gafas de protección. Papel absorbente. Pipetas o multipipetas, automáticas o semiautomáticas, ajustables o fijas, que pueden medir de 10 µl a µl, y 1 ml, 2 ml y 10 ml. Probetas graduadas de 25 ml, 50 ml, 100 ml y ml. Hipoclorito de sodio (lejía) y bicarbonato de sodio. Contenedor de desechos contaminados. Tubos de un solo uso. (*) Para obtener una información más detallada sobre los aparatos validados por nuestros servicios técnicos, consúltennos. 7.2 Reconstitución de los reactivos R1: Esperar a que adquiera la temperatura ambiente ( C) antes de abrir la bolsa. Sacar el soporte y volver a poner inmediatamente en la bolsa las tiras no utilizadas, comprobando que esté presente el secante. Volver a cerrar minuciosamente la bolsa y poner de nuevo a +2-8 C. R2: Diluir a 1/20 la solución R2 con agua destilada: 50 ml de R2 en 950 ml de agua destilada. Se obtiene de este modo la solución lista para usar. Tener previstos 350 ml de solución de lavado diluida para una placa entera de 12 tiras en modo de lavado manual. R3, R4, R5 : : Diluir a 1/21 en el diluyente (R7) (ejemplo: 15 µl R µl R7). R6a : : El antígeno de T. gondii está liofilizado. Para analizar 6 tiras, reconstituir un vial de antígeno liofilizado añadiéndole 14 ml de diluyente (R7). Mezclar bien. Una vez diluida, la solución antigénica (R6a+R7) debe quedar completamente transparente. R6 (R6a+R6b) : Solución activa de conjugado: Añadir 140 µl de conjugado (R6b) en cada vial de antígeno de T. gondii reconstituido (R6a diluido). Mezclar bien. La solución activa de conjugado debe reconstituirse al menos 1 hora antes de usarla. 7.3 Conservación y validez de los reactivos abiertos y/o reconstituidos El kit debe conservarse a +2-8 C. Cada elemento del kit conservado a +2-8 C antes de la apertura puede utilizarse hasta la fecha de caducidad indicada en el envase. R1: Después de abrir, las tiras conservadas correctamente de nuevo en la bolsa cerrada permanecen estables durante 8 semanas a +2-8 C (comprobar que esté presente el secante). R2: Después de la dilución, la solución de lavado se conserva 2 semanas a C. Después de abrir y si no hay presencia de contaminación, la solución de lavado concentrada puede conservarse a C hasta la fecha indicada en la etiqueta.

9 R3, R4, R5, R6b, R7: Después de abrir y si no hay presencia de contaminación, los reactivos conservados a +2-8 C son estables durante 8 semanas. R6 (R6a+R6b): Después de reconstruir, la solución de trabajo del conjugado es estable 8 horas a temperatura ambiente ( C) o 4 semanas a +2-8 C. R9: Después de abrir y si no hay presencia de contaminación, el reactivo conservado a +2-8 C es estable durante 8 semanas. R10: Después de abrir y si no hay presencia de contaminación, el reactivo conservado a +2-8 C es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. 7.4 Modo de actuación Seguir al pie de la letra el protocolo propuesto y aplicar las Buenas Prácticas de Laboratorio. Antes de usar, esperar a que todos los reactivos se pongan a temperatura ambiente ( C). El uso de pocillos frágiles requiere especial cuidado durante la manipulación. Utilizar el calibrador y los sueros de controles en cada dosificación para validar la calidad de la prueba. 1. Establecer cuidadosamente el plan de distribución y de identificación del calibrador, de los sueros de control y de las muestras de pacientes. 2. Preparar la solución de lavado diluida (R2) [Consultar el Capítulo 7.2]. 3. Sacar el soporte y las tiras (R1) del envase protector [Consultar el Capítulo 7.2] 4. Preparar la solución de conjugado R6 (R6a+R6b) [Consultar el Capítulo 7.2]. 5. Disolver el calibrador (R4), los sueros de control (R3, R5) y las muestras de pacientes a someter a prueba (S1, S2, etc.) a 1/21 en el diluyente (R7), es decir 15 µl de muestra y 300 µl de diluyente (R7) [Consultar el Capítulo 7.2]. Homogeneizar correctamente (vórtex). 6. Distribuir en cada pocillo 200 µl del calibrador, de los sueros de control y de las muestras diluidas según el esquema siguiente: A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 41

10 7. Cubrir la microplaca con una película adhesiva apoyando bien sobre toda la superficie para garantizar la estanqueidad, a continuación incubar inmediatamente la microplaca al baño maría con termostato o en una incubadora seca de microplacas durante 1 hora ± 5 minutos a 37 C ± 1 C. 8. Al final de la primera incubación, retirar el film adhesivo, aspirar el contenido de todos los pocillos en un contenido para desechos contaminados (que contienen hipoclorito de sodio) y proceder a 4 lavados con 350 µl de la solución de lavado (R2). Secar las tiras empapándolas en una hoja de papel absorbente y golpear ligeramente para eliminar la totalidad de la solución de lavado. 9. Distribuir 200 µl de la solución de trabajo del conjugado (R6) en todos los pocillos. Agitar delicadamente esta solución antes de usarla. 10. Tapar la microplaca de un film adhesivo apoyando bien sobre toda la superficie para garantizar la estanqueidad. Incubar la microplaca al baño maría con termostato o en una incubadora seca de microplacas durante 1 hora ± 5 minutos a 37 C ± 1 C. 11. Al final de la primera incubación, retirar el film adhesivo, aspirar el contenido de todos los pocillos en un contenido para desechos contaminados (que contienen hipoclorito de sodio) y proceder a 4 lavados con 350 µl de la solución de lavado (R2). Secar las tiras empapándolas en una hoja de papel absorbente y golpear ligeramente para eliminar la totalidad de la solución de lavado. 12. Distribuir rápidamente, y al abrigo de la luz viva, 200 µl del cromógeno (R9) en todas las cúpulas. Dejar la reacción desarrollarse en la oscuridad durante 30 ± 5 minutos a temperatura ambiente ( C). Durante esta incubación, no utilizar el film adhesivo. 13. Detener la reacción enzimática añadiendo 100 µl de la solución de parada (R10) en cada pocillo. Adoptar la misma secuencia y el mismo ritmo de distribución que para la solución de revelado. 14. Secar minuciosamente la parte de abajo de las placas. Leer la densidad óptica a 450/620 nm con ayuda de un lector de placas en los 30 minutos que siguen a la parada de la reacción. Las tiras deben conservarse siempre al abrigo de la luz antes de la lectura. 15. Asegurarse, antes de la transcripción de los resultados, de la concordancia entre la lectura y el plan de distribución de las placas y de las muestras. 8. CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 8.1 Cálculo del valor umbral (VU) El valor umbral VU corresponde a la media de las densidades ópticas (DO) de los duplicados del Calibrador (R4): VU = media DO R4 42

11 8.2 Cálculo de la Ratio de la Muestra Los resultados para una muestra dada se expresan bajo forma de una ratio con ayuda de la fórmula siguiente: Ratio Muestra = DO muestra/vu 8.3 Control de calidad Analizar los resultados de DO obtenidos con el calibrador, los sueros de control en cada microplaca y para cada serie. Para validar la manipulación, hay que respetar los criterios siguientes: Valores de las densidades ópticas: VU 0,300 0,80 x VU < DO R4 Repl.1 < 1,20 x VU 0,80 x VU < DO R4 Repl.2 < 1,20 x VU (La DO individual de cada uno de los duplicados del Calibrador R4 no debe separarse más de 20% del valor umbral) Informes de las densidades ópticas: Ratio R3 (DO R3 / VU) 0,30 Ratio R5 (DO R5 / VU) 1,80 Si estos criterios no se cumplen, volver a empezar la manipulación. 8.4 Interpretación de los resultados Ratio muestra Resultado Interpretación Título < 0,80 Negativo La muestra se considera negativa para la presencia de anticuerpos IgM anti-t. gondii. 0,80 Título < 1,00 Dudoso La muestra se considera dudosa para la presencia de anticuerpos IgM anti-t. gondii. El resultado debe ser confirmado por una nueva prueba realizada en una nueva muestra extraída como mínimo 3 semanas después de la fecha del 1er examen. Título 1,00 Positivo La muestra se considera positiva para la presencia de anticuerpos IgM anti-t. gondii. 8.5 Posibles causas de error El origen de las reacciones no validadas o no reproducibles guarda a menudo en relación con las causas siguientes: Lavado insuficiente de las microplacas. Contaminación de las muestras negativas por un suero o un plasma que contenga un título elevado de anticuerpos. 43

12 Contaminación puntual de la solución de revelado por agentes químicos oxidantes (lejía, iones metálicos, etc.). Contaminación puntual de la solución de parada. 9. RESULTADOS Los resultados de Platelia Toxo IgM fueron evaluados en 2 centros sobre un total de 863 muestras de mujeres embarazadas y donantes de sangre. Adicionalmente, se evaluaron los resultados del kit Platelia Toxo IgM sobre 47 muestras de sangre de cordón. 9.1 Prevalencia La prevalencia de anticuerpos IgM anti-toxo con Platelia Toxo IgM se calculó sobre un panel de 500 muestras procedentes de mujeres embarazadas. 15 muestras eran positivas en anticuerpos IgM anti-toxo. La prevalencia medida con el ensayo Platelia Toxo IgM está establecida en el 3 % (15/500). 9.2 Especificidad La especificidad se calculó sobre un panel de 737 muestras negativas con Platelia Toxo IgM TMB (72751), procedentes de 2 centros situados en Francia y divididas como sigue: 154 sueros de donantes de sangre 583 sueros de mujeres embarazadas Población analizada / centro Centro 1 Centro 2 Mujeres embarazadas Donantes de sangre Mujeres embarazadas Número de sueros Negativo Equívoco Positivo Especificidad Total * Los resultados equívocos se consideraron positivos para el cálculo de la especificidad. [IC 95%] = Intervalo de confianza del 95 %. 100,0% (102/102) [97,1-100%] 100,0% (154/154) [98,1-100%] 99.8% (480/481) [ %] 99.9% (736/737) [ %] 44

13 9.3 Sensibilidad La sensibilidad se calculó sobre un panel de 69 muestras positivas con Platelia Toxo IgM TMB (72751), procedentes de 2 centros situados en Francia y divididos como sigue: 4 sueros de donantes de sangre 65 sueros de mujeres embarazadas Platelia Toxo IgM (72841) Platelia Toxo IgM TMB (72751) Equívoco* Positivo Total Negativo Equívoco* Positivo Total Sensibilidad relativa * 69/69 100,0% [IC 95% = 94,8% - 100,0%] * Los resultados equívocos se consideraron positivos para el cálculo de la sensibilidad [IC95%] = Intervalo de confianza del 95% La muestra positiva discrepante con Platelia Toxo IgM fuera confirmada positiva con método ISAGA. Además, se probaron 57 muestras sobre un panel de 19 seroconversiones. Sobre estas 19 seroconversiones, 18 se detectaron de manera comparable y una seroconversión presentó un desfase de una muestra a favor del método de referencia. 9.4 Resultados en muestras de sangre de cordón 47 muestras de sangre de cordón se testaron utilizando el protocolo descrito en la sección 7.4 (dilución de la muestra 1/21): 22 muestras con toxoplasmosis congénita confirmada 18 muestras de infecciones maternas anteriores 7 muestras sin infección. De las 20 muestras de toxoplasmosis fueron positivas (18) o dudosas (2) con Platelia Toxo IgM (72841). Sin embargo, todas las muestras de infecciones anteriores o sin infección fueron negativas. 45

14 Platelia Toxo IgM (72841) Platelia Toxo IgG (72840) Positivo Equívoco Negativo Positivo Equívoco Negativo Toxoplasmosis congénita (n=22) Infección materna anterior (n=18) Ausencia de infección (n=7) Reactividad cruzada Se analizó un panel de 205 muestras, incluidas 167 muestras positivas en CMV, rubéola, EBV, HSV, VZV, paperas, sarampión y VIH, y 38 muestras positivas en factor reumatoide, autoanticuerpos y anticuerpos heterófilos, y muestras de mieloma con Platelia Toxo IgM y un ensayo inmunoenzimático comercial para la detección de anticuerpos IgM anti-toxo. De esas muestras, 2 resultaron positivas y acordes con el kit de ensayo inmunoenzimático usado para la comparación : 1 muestra positiva en anti- EBV y 1 muestra positiva en anti-hsv 2 IgG. 9.6 Precisión Precisión intra-análisis (repetibilidad): Con el fin de evaluar la repetibilidad intra-análisis, una muestra negativa y tres muestras positivas han sido testadas en 32 ocasiones, en una misma serie. La ratio (DO muestra /VU) se ha determinado para cada muestra. La media de la ratios, la desviación estándar (DS) y el coeficiente de variación (%CV) para cada muestra se ofrecen en el cuadro siguiente. Precisión intra-análisis (repetibilidad) N=32 Muestra Negativa Muestra positiva débil Muestra positiva Ratio (DO muestra / valor umbral) Muestra positiva fuerte Media 0,05 1,92 3,23 4,49 DS 0 0,04 0,07 0,10 % CV 5,0% 2,1% 2,3% 2,3% 46

15 Precisión inter-análisis (reproducibilidad): Con el fin de evaluar la reproducibilidad inter-análisis, las cuatro muestras (una negativa y tres positivas) se han evaluado cada una en duplicado, en dos series al día, durante un periodo total de 20 días. La ratio (DO muestra /VU) se ha determinado para cada muestra. La media de la ratios, la desviación estándar (DS) y el coeficiente de variación (%CV) para cada muestra se ofrecen en el cuadro siguiente. Precisión inter-análisis (reproducibilidad) N=80 Muestra Negativa Muestra positiva débil Muestra positiva Ratio (DO muestra / valor umbral) Muestra positiva fuerte Media 0,04 2,05 3,28 4,64 DS 0,01 0,06 0,10 0,14 % CV 21,0% 2,8% 3,1% 3,0% 10. LÍMITES DE USO Sólo puede establecerse el diagnóstico de infección por T. gondii basándose en una combinación de datos clínicos y biológicos. El resultado de una única prueba de titulación de anticuerpos IgM anti-t. gondii no constituye prueba suficiente para el diagnóstico de una infección reciente. El diagnóstico de una infección reciente sólo puede realizarse con información completa sobre el paciente que incluya datos clínicos y biológicos (aumento significativo de anticuerpos IgG anti-t. gondii en 2 sueros del paciente extraídos con un intervalo de 3 semanas y analizados a la vez, presencia de IgM anti-t. gondii en un nivel significativo, demostración de baja avidez de los IgG). La presencia de anticuerpos IgM anti-t. gondii no constituye prueba suficiente para confirmar una infección reciente, ya que los IgM pueden permanecer varios meses o incluso años tras la infección. Cuando se detectan IgM, debería realizarse una determinación cuantitativa de los anticuerpos IgG anti-t. gondii, así como un seguimiento de la evolución de los anticuerpos anti-t. gondii en al menos un segundo suero extraído tres semanas más tarde. Si se analiza una muestra demasiado temprano durante una primoinfección reciente, es posible que los anticuerpos IgM anti-t. gondii no estén aún presentes. Si existen sospechas, debería extraerse y analizarse una segunda muestra unas 3 semanas más tarde. 47

16 11. CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTE Todos los productos fabricados y comercializados por la sociedad Bio-Rad están bajo un sistema de garantía de la calidad desde la recepción de las materias primas hasta la comercialización de los productos acabados. Cada lote de producto acabado es objeto de un control de calidad y sólo se comercializa si cumple con los criterios de aceptación. La documentación relativa a la producción y al control de cada lote queda en manos del fabricante. 12. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Ver la versión Inglesa. 48

17 12. REFERENCES 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin.Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxo-plasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G. : Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti-toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol ; 35, LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol.Infect. Dis. 1993; 3, WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7,

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