Diferentes mecanismos de transporte de proteínas

Transcripción

1 Diferentes mecanismos de transporte de proteínas Todos los mecanismos involucran señales de tránsito presentes en las proteínas y receptores sobre la organela en cuestión

2 Existen dos clases de señales que dirigen a las proteínas hacia el compartimento adecuado

3 Importancia de la regulación de la localización nucleo/citoplasmática en sistemas biológicos a- Como modo de controlar la activación de factores de transcripción b- Como modo de generar un retraso entre la síntesis de una proteína y su capacidad de actuar en el núcleo c- Para asegurar la maduración de moléculas antes de que estén disponibles para su uso (control de calidad) Mecanismos que controlan la localización nucleo/citoplasmática 1- La proteína a transportar sufre modificaciones que determinan su capacidad de interaccionar con los receptores de importación o exportación nuclear 2- Los complejos proteína receptor están secuestrados en un compartimento de la célula que lo torna insoluble impidiéndole interaccionar con el complejo del poro nuclear 3- Control a nivel de la actividad de la maquinaria soluble de transporte 4- Modificaciones en el complejo del poro nuclear

4 Transporte nuclear -Factores de transcripción (IN-OUT) - Kinasas/Proteínas regulatorias (IN-OUT) - Histonas (IN) - mrnas (OUT) - trnas (OUT) - Proteínas/subunidades ribosomales (IN-OUT)

5 -Las membranas nucleares interna y externa tienen distinta composición proteica Interna: Proteínas que anclan a la cromatina Proteínas que interaccionan con la lámina nuclear Externa: Sitios de anclaje para ribosomas (idem ER) -Los complejos de poro nuclear regulan la importación y exportación de moléculas La lámina nuclear

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8 El complejo del poro nuclear está compuesto por ~30 proteínas diferentes organizadas con simetría octogonal (~125 Mda). En total unos 1000 polipéptidos

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10 Proteínas mayores de 40 Kda no difunden libremente a través del poro Para proteínas mas pequeñas, la velocidad de difusión es proporcional al tamaño

11 Importación al núcleo

12 Receptores de transporte nuclear (de importación o de exportación) - Interacción directa con moléculas a transportar o mediante adaptadores - Nucleoporinas tienen repeticiones FG que interactúan con los receptores de importación o exportación nuclear Receptor de Importación o exportación nuclear Ej CRM1 exportina-t Importina alfa Importina beta

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14 Identificación de los componentes necesarios para la importación nuclear

15 Señales de localización nuclear RKRKESNRESARRSRYRK bipartita MSERKRREKL monopartita

16 Estrategia: Sobre-expresion de Sima en líneas transgénicas Normoxia

17 Sima se localiza en el núcleo sólo en hipoxia { Engrailed gal4 -UAS GFPn. gal -UAS Sima Normoxia Hipoxia

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20 Exportación nuclear

21 Receptores de transporte nuclear (de importación o de exportación) - Interacción directa con moléculas a transportar o mediante adaptadores - Nucleoporinas tienen repeticiones FG que interactúan con los receptores de importación o exportación nuclear Receptor de Importación o exportación nuclear Ej CRM1 exportina-t Importina alfa Importina beta

22 La Leptomicina B inhibe específicamente al receptor de Exportación nuclear CRM1

23 Señales de exportación nuclear

24 Posibles NES en la secuencia de Sima

25 En mutantes para el exportador CRM1/Embargoed Sima se exporta mas lentamente

26 Líneas que sobre-expresan al transportador CRM1/Embargoed exportan a Sima mas rápidamente

27 Actividad de cada una de las NES aisladas de Sima

28 Funcionalidad de las NES en el contexto de la proteína entera

29 La GTPasa Ran determina la dirección del transporte 1- Ran se encuentra tanto en el citosol como en el núcleo 2- Ran puede tomar 2 conformaciones alternativas a) Unida a GTP; b) Unida a GDP 3- Existen proteínas regulatorias: Ran GAP + Ran BP (citosólicas) y Ran GEF (nuclear) Ran GAP (GTPase activating protein) + Ran BP (Binding protein) Ran GTP Ran GDP Ran GEF (Guanine Nucleotide Exchange Factor)

30 Transporte a través del complejo del poro nuclear 1- Ran-GTP (nuclear) tiene afinidad por los receptores de importación nuclear cargados y provoca la liberación de la proteína importada 2- Ran GTP (nuclear) tiene afinidad por los receptores de exportación nuclear cargados y favorece el pasaje a través del poro hacia el citosol RanGap RanGEF Importinas Exportinas

31 Cómo se genera la distribución asimétrica de Ran GEF (nuclear), Ran GAP y Ran BP (citosólicas)? Ran GEF es activamente importada al núcleo a través del sistema dependiente de importina beta Ran GAP y Ran BP son activamente exportadas por el sistema exportina beta/crm1 Pero para que esto ocurra se necesita distribución asimétrica inicial de Ran GAP, Ran BP (citoplasmáticas) y Ran GEF (nuclear) Cómo se las arregla la célula para generar estas diferencias inmediatamente después de la mitosis?

32 Disociación y re-formación de la envoltura nuclear durante la mitosis

33 y qué pasa con Ran GEF, Ran GAP y Ran BP durante la mitosis? - Ran GEF queda asociada a la cromatina - Ran GAP y Ran BP quedan asociadas a las proteínas de las fibras citoplasmáticas del complejo del poro (Ran BP2-SUMO)

34 La exportación nuclear como etapa de control de calidad: los trnas

35 DETERMINACIÓN DEL EJE DORSO-VENTRAL

36 La proteína Dorsal entra al núcleo sólo en las células ventrales Roth et al, 1989 Rushlow et al, 1989 Steward, 1989 A/P: Sinsicio DV: embrión celularizado wt Mutante dorsalizado Mutante ventralizado Dorsal induce la transcripción de twist, snail y rhomboid y Reprime la transcripción de dpp y zerknullt

37 NF-kappaB/Dorsal están anclados al citoplasma por IkappaB/Cactus 1- Pipe activa a Nudel (mecanismo desconocido). 2- Nudel inicia la activación de 3 serin-proteasas: Gastrulation defective, Snake y Easter 3- Easter cliva a Spatzle activándola. 4- Spatzle activa al receptor Toll. 5- La estimulación de Toll activa a la kinasa Pelle (que necesita a Tube para asociarse a la membrana) 6- Directa o indirectamente, Pelle fosforila a Cactus. 7- Una vez fosforilada, Cactus se degrada en el proteasoma y libera Dorsal para que ingrese al núcleo (Kidd, 1992; Shelton and Wasserman, 1993; Walen and Steward, 1993; Reach et al, 1996).