Drosophila III. OBTENCIÓN Y OBSERVACIÓN DE CROMOSOMAS POLITENICOS A PARTIR DE Drosophila virilis

Transcripción

1 PRÁCTICA 3 Drosophila III. OBTENCIÓN Y OBSERVACIÓN DE CROMOSOMAS POLITENICOS A PARTIR DE Drosophila virilis INTRODUCCIÓN En 1881 Balbiani descubrió que en los núcleos de las glándulas salivares de Drosophila melanogaster, durante el período larvario, no se daba la apariencia típica descrita durante la metafase, sino que los cromosomas aparecían como estructuras enormemente largas y tras aplicar un determinado colorante, se distinguían en ellos bandas e interbandas. El origen de estos cromosomas especiales se debe a un fenómeno llamado endomitosis, en el cual se produce la replicación cromosómica sin división celular (durante la interfase mitótica), de manera que los cromosomas duplican sus cromátidas (duplocromososmas), pudiendo llegar hasta ocho si vuelve a repetirse la anomalía. Los cromosomas así constituidos pueden separar luego las cromátidas por parejas, con lo cual el número de cromosomas se duplica, cuadruplica, etc. Aunque las bandas en cromosomas humanos representen segmentos lineales muy largos de DNA, las bandas en los cromosomas de Drosophila representan segmentos más cortos de solo a pares de bases. Las características estructurales de los cromosomas de estos insectos justifican el hecho de que tales segmentos cortos puedan ser observados al microscopio óptico. Parece ser que la única molécula de DNA doble de los cromosomas salivares en insectos está copiada repetidamente (unas veces) en formaciones paralelas de DNA idénticas. Esta amplificación sin separación, llamada politenia, da lugar a gruesos haces de moléculas de DNA paralelas, que representan el mismo patrón de bandas a través del ancho del haz como se observa en las figuras. 14

2 El aspecto normal de un núcleo de las glándulas salivares en Drosophila es el siguiente: todos los cromosomas se reúnen en un punto común, llamado cromocentro, alrededor del que irradian cinco largos brazos. Los cinco brazos que irradian del cromocentro resultan de la unión íntima de los brazos de cromosomas homólogos ya que presentan apareamiento somático parecido al que se da en la profase meiótica, y se denominan: - X, de la unión de los brazos largos de los cromosomas X de la hembra - 2L y 2R, de la unión de los brazos izquierdo y derecho del par II - 3L y 3R, de la unión de los brazos izquierdo y derecho del par III - el par IV y el cromosoma Y del macho apenas sobresalen del cromocentro La denominación L (left) y R (right) se utiliza para diferenciar entre los brazos cromosómicos. romosomas politénicos en Drosophila melanogaster También puede observarse que un cierto porcentaje de bandas, dependiendo del desarrollo de la larva, muestren un aspecto muy hinchado de puffs o engrosamiento cromosómico. Dichas zonas están relacionadas con puntos de síntesis activa de RNA. 15

3 Los cromosomas politénicos han proporcionado información sobre diversos aspectos importantes en Genética, entre ellos: - Localización de genes: las deleciones se han empleado en Drosophila para identificar loci génicos situados sobre bandas específicas de los cromosomas politénicos. - Actividad transcripcional: algunas de las zonas de los cromosomas politénicos se encuentran ensanchadas o difusas, y se conocen como pufs cromosómicos. Actualmente se sabe que estas regiones están relacionadas con el aumento de la actividad transcripcional. - Estudios filogenéticos: mediante el análisis de los polimorfismos cromosómicos y reconocimiento de variaciones estructurales en los cromosomas. OBJETIVO DE LA PRÁCTICA Observación microscópica de cromosomas politénicos a partir de larvas de Drosophila virilis. MATERIALES Organismos El material de partida para la realización de la práctica serán larvas de la especie Drosophila virilis. Composición y preparación del colorante - Carmín g - Ácido acético 45 ml - Agua destilada 55 ml Se preparan 100 ml de ácido acético al 45 % y se adicionan a un matraz erlenmeyer de 250 ml. A continuación se disuelven 2 g de carmín, y se calienta la disolución hasta el punto de ebullición durante 1 hora y agitando suavemente, teniendo la precaución de que no hierva (utilizar mascarilla). Se deja enfriar y a continuación se filtra con papel de filtro y en campana extractora. Después se conserva en un frasco topacio. Productos y equipos El material instrumental necesario es el siguiente: -Solución de suero salino (NaCl al 0,6%) -Solución de carmín acético al 2% -Pinzas de disección -Lancetas 16

4 -Aguja enmangada -Portaobjetos -Cubreobjetos -Mechero de alcohol -Papel de filtro -Lupa binocular -Microscopio óptico PROCEDIMIENTO Para realizar las preparaciones microscópicas se deberá seguir el siguiente procedimiento: 1. Colocar la larva sobre una gota de suero salino (NaCl 0,6%) en un portaobjeto limpio situado sobre la plataforma de la lupa de disección (fondo negro). Las glándulas se encuentran unidas a la trompa que poseen las larvas en el extremo anterior, identificables por poseer unas plaquitas de color negro (mandíbulas). Para extraer las glándulas, usar una aguja enmangada o pinzas para sujetar la parte posterior de la larva y otra aguja o una lanceta para decapitarlas. En el movimiento de decapitación, que habrá de ser lento, saldrán las glándulas apareadas, fáciles de identificar por su aspecto de bolsitas transparentes a ambos lados del estómago. ESTRUCTURA INTERNA DE UNA LARVA DE Drosophila ESQUEMA DE EXTRACCIÓN DE LAS GLÁNDULAS SALIVARES 17

5 2. Una vez extraídas y aisladas las glándulas junto con los cuerpos grasos, colocarlas en un portaobjetos limpio sin los restos de larva. 3. Eliminar la solución salina con papel secante si estuviera en exceso. 4. Echar inmediatamente, antes de que se sequen, 2 ó 3 gotas de fijador Carnoy (ac. acético:etanol, 1:3), dejándolo actuar hasta que se evapore. 5. Separar (si los hubiera) los cuerpos grasos de las glándulas, que se eliminarán fácilmente por simple contacto de las agujas. 6. Echar inmediatamente 2 ó 3 gotas de carmín acético al 2%. 7. Dejar que se tiñan durante 15 minutos, calentando suavemente en la llama del mechero o en placa calefactora, de forma que la temperatura no sobrepase el calor que soporta el dorso de la mano. Añadir más colorante si se va evaporando. 8. Retirar con cuidado parte del colorante con un papel secante. 9. Añadir 2 gotas más de carmín acético y colocar un cubre sobre las glándulas. Para extender los cromosomas realizar un aplastamiento sobre el cubre con el dedo pulgar (usar papel de filtro) y evitar el movimiento lateral del cubre. 10. Observar la preparación al Microscopio Óptico con el objetivo de 40X. CROMOSOMAS POLITÉNICOS DE Drosophila virilis 18

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