* Laboratorio de Insectos Vectores.

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1 EFECTO DE TRES EXTRACTOS DE BACILLUS THURINGIENSIS EN LARVAS DE AEDES AEGYPTI L. Y CULEX PIPIENS VAR. QUINQUEFASCIATUS SAY (DIPTERA: CULICIDAE) EN CONDICIONES DE LABORATORIO CLAUDIO PÉREZ-ÜRONA* MA. LursA RooRÍGUEz-TovAR* Lurs GALÁN-WoNo** * Laboratorio de Insectos Vectores. ** Laboratorio de Microbiología Industrial y del Suelo. Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Autónoma de Nuevo León Apdo. Postal 2790 Monterrey, Nuevo León. MEXICO Folia Entomológica Mexicana No. 63: ( 1985). Recibido para publicación: 1 :~ noviembre Aceptado para publicación: 25 junio

2 RESUMEN Entre los mosquitos culícidos que más molestias causan Pn el área metropolitana de Monterrey, N.L., se encu!'ntran Aedes aegypti Linnaeus y Culex pipiens var. quinquefasciatus Say, los cuales son portadores potenciales de diversos patógt>nos causantes de enfermedadps en el hombre y animales. El presente trabajo consistió en probar los extractos dp tres aislados de suplo de llacillus thuringiensis Bt"rliner denominados GM-1, GM-7 y GM-1 :1 contra larvas de mosquitos Aedes aegypti L. y Culex pipiens var. quinquefasciatus Say colonizados en el lnsectario de la Facultad de Ciencias Biológicas de la U.A.N.L. Se utilizaron larvas de :ler. estadio y se probaron cinco dosis de cada extracto ( 100, 1 O, 1.0, 0.1 y 0.01 mg/1) preparadas en agua destilada y adicionando dieta específica para larvas. I.a I.Cso obtenida para cada uno de los extractos a las 72 h fueron GM-1: 1410 mg/1; IPS-7!l: 0.2B mg/1 contra A. aegypti. Contra C. pipien. var. quinquefasciatus GM-1: :lltí mg/l; GM-7: 12.'i.!l9 mg/l; IPS-7!l: 0.:18 mg/1; GM-1:1 no tuvo efecto alguno en las dos especies de mosquitos, encontrándose que estos aislados, debido a su baja toxicidad no son apropiados para t"l control de mosquitos. PALABRAS CLAVE: Díptera, mosquitos, control biológico, laboratorio, México. ARSTRACT Aedes aegypti I.innaeus and Culex pipiens quinquefasciatus Say are among the most annoying mosquitoes that usually occur in the metropolitan area of Monterrey N.L., thm they are considered a domestic plague, moreover they are potential carriers of viruses such as Dengue, Yellow Fevcr and Encephalitis, also filarids like Wuchereria bancrofti and Dirofilaría ímmítis. This study consisted of comparative laboratory bioassays of llacillus thurin.;iensis BPrlincr soil isolates: GM-1, GM-7 and GM-J:l and one reference strain of llacillu.r thuríngiensis var. israeliensis (IPS-7!l with an arbitrary 1000 IU/mg) vs. larvae of A. aegypti and C. pijliens var. quinquefasciatus mosquitoes (obtained from colonies established in the Faculty of Biological Sciences of the Autonomus Uni, ersity of Nut"vo l.!'on). Five dosages of each extract were prepared by serial dilution ( 100, 1 O, 1, 0.1 and 0.01 mg/1). Fifty third stage larvae (four da y old and 1..'i mg A. ae.;)'/jti larvae: five day old and 1.ti mg C. pípíens var. quínquefasciatus larva e) wcre placed in plastic cups containing 100 mi of the prepared extracts with larval diet. Mortality counts were carried out at O..'i, 1, 4,!l, 12, 24, 48 and 72 hn. aft!'r the start of the assays. Probit analysis was used to calculate final LCso after 72 hrs., wich were as follows: IPS-7!1: 0.2B mg/l; GM-1: 1410 mg/1 vs A. aegypti; IPS-7!1: O.:HI mg/l; GM-1: :\1ti mg/1; GM-7: 12.'i.89 mg/1 vs C. pipiens var quinquefasáatus: GM-1 :1 had no effect whatsoever against any of the two mosquito larvar. lt is concluded that the three soil isolates: GM-1, GM-7 and GM-1:1, due to their low toxicity against mosquito larvae are not competen! with the internationa1 standard IPS-78, and thus they are not appropiate for the control of mosquitos. KEY WORDS: Diptera, mosquitoes, biological control, laboratory, Mexico. 76

3 INTRODUCCIÓN Los mosquitos Aedes aegypti L. y Culex pipiens var. quinquefasciatus Say constituyen plagas domésticas debido a que se crían en cisternas y todo tipo de recipientes que se dejan cerca de donde vive el hombre en hacinamiento (Hunter 1973). El mosquito Aedes aegypti, comunmente llamado "Mosquito Tigre" prefiere alimentarse de sangre humana y puede transmitir los virus del Dengue y Fiebre Amarilla (Colvard, 1978). El mosquito Culex pipiens var. quinquefasciatus generalmente se alimenta de sangre de aves pero ocasionalmente muerde al hombre y otros animales de sangre caliente, la hembra de este mosquito puede transmitir los diferentes virus de Encefalitis y las Filarías Wuchereria bancrofti (causante de Elefantiasis en el hombre) y Dirofilaria inmitis causante del Gusano del Corazón del perro (James y Harwood, 1969). Ultimamente los mosquitos han presentado resistencia a los diferentes insecticidas químicos tales como órganofosforados, dieldrín, DDT, carbamatos y piretrinas (Fontaine, 1980), los cuales hoy son poco efectivos y debido a esto ha incrementado la búsqueda de otros medios para combatir a estos insectos. Una alternativa es el uso de insecticidas microbiológicos, un ejemplo sobresaliente es la "Enfermedad Lechosa" causada por Bacillus thuringiensis. Una subespecie de esta bacteria, B. thuringiensis var. israeliensis o serotipo H-14 posee virulencia casi exclusiva contra culícidos y simúlidos (Ali, 1981). B. thuringiensis produce varias toxinas, de las cuales la Delta endotoxina es la que se usa como agente entomopatégeno. Esta toxina, también llamada "cristal", actúa como un veneno estomacal y tiene la ventaja de que no es tóxica para los demás organismos que se encuentran en el hábitat de la larva del mosquito (Miura y col. 1981). Ikeshoji en 1970, encontró que las densidades larvarias mayores a cuatro larvas por m] traen como consecuencia estadios larvarios largos, adultos enanos y liberación de "factores tóxicos" en el medio de las larvas. Dadd en 1982, demostró que la levadura en polvo actúa como fuerte fagoestimulante de las larvas de mosquito. Tyrrell en 1979, usó B. thuringiensis var. israeliensis ONR60A contra larvas de Aedes aegypti y encuentra una LCw de 9 X I0-4 mg/ml. El Programa de Control de Oncocercosis en Africa Occidental, en 1982 utilizó de Bacillus thuringiensis H-14 en lugar de los órganofosforados que se utilizaban contra simúlidos (TDR Newsletter, 1983). Klowden en 1983, probó B. thuringiensis var. israeliensis en machos adultos de Aedes aegypti administrándolo por lavativa y encontró una LCso de 0.04 microgramos / mg. Ya que se ha comprobado la necesidad de encontrar nuevos medios para combatir a estos mosquitos, este trabajo tuvo los siguientes objetivos: l. Establecer bajo condiciones de laboratorio, colonias de Aedes aegypti L. y Culex pipiens var. quinquefasciatus Say para el desarrollo de este trabajo 77

4 (que es sólo parte de un proyecto mayor, actualmente en marcha en la Facultad de Ciencias Biológicas de la U.A.N.L.) fue necesario el establecimiento de estas colonias, las cuales también servirán para posibles estudios posteriores. 2. Llevar a cabo bioensayos de toxicidad de los extractos de las cepas. GM-1, GM-7 y GM-13 de Bacillus thuringiensis (aislados del suelo de diferentes estados de México) contra larvas de Aedes aegypti y Culex pipiens var. quinquefasciatus. MATERIAL y MÉTODOS l. Establecimiento de las colonias de mosquitos: La propagación de mosquitos fue a partir de larvas colectadas en la zona urbana de San Nicolás de los Garza,.N.L., las larvas y adultos obtenidos posteriormente se identificaron de acuerdo al Manual del Departamento de Educación y Salud de los Estados Unidos. Las larvas se colocaron en recipientes de plástico con una mezcla de 50% agua destilada y 50% agua serenada con NaCI al 0.5% (Parker, 1982). Las larvas se alimentaron con una mezcla de 50% levadura en polvo, 25% alimento para perro y 25% cereal proteinado en hojuelas, se colocó una larva por cada cm 2 de superficie del recipiente ( lkeshoji, 1970). Las pupas se colocaron en un recipiente dentro de la jaula de los adultos. Para alimentar a los mosquitos machos, se colocó un recipiente con algodón y miel de abeja rebajada al 10% en agua dentro de las jaulas. Las hembras de Culex pipiens var. quinquefasciatus se alimentaron dejando una gallina semi-inmovilizada dentro de la jaula por espacio de una noche cada tercer día; a las hembras de Aedes aegypti se les permitió alimentarse sobre un brazo humano durante quince minutos cada tercer día (Mulla, 1980). Los huevecillos de Aedes aegypti se colectaron en un recipiente con papel filtro humedecido y adherido a las paredes, las tiras de papel se colectaron en una cámara humeda por espacio de tres días y posteriormente se dejaron secar lentamente. 2. Extractos Bacterianos Utilizados: Los extractos de Bacillus thuringiensis fueron proporcionados por el Laboratorio de Microbiología Industiral y del Suelo de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Autónoma de N u evo León, y fueron los siguientes: GM-1 Cultivada en: Agua de Coco (1 Brix); Harina de Soya 0.5-1% y CaC g/1. GM-7 y GM-13 ambas cultivadas en: Dextrosa 1.5%; Líquido de Remojo de Maíz 1%; Harina de Soya 2% y CaC %. IPS-78: Estandard internacional de Bacillus thuringiensis var. israeliensis, con un equivalente de 1000 UI/mg. donado a la Facultad de Ciencias Biológicas por la Dra. debarjac del Instituto Pasteur de Francia. 3. Bioensayos. Se sig-uió el procedimiento usado por lgnoffo ( 1981): se probaron cinco dosis y un testigo de cada extracto. Las dosis usadas fueron: 100, 10, 1.0, 0.1 y 0.01 mg/1, la concentración inicial se preparó disolviendo 10 78

5 mg. del extracto en 100 ml de agua destilada, el resto de las dosis se obtuvieron por diluciones en serie usando pipetas volumétricas de 10 mi, los extractos ya preparados se colocaron en vasos de plástico, se agregaron cincuenta larvas de mosquito en cada vaso y se adicionó dieta para larvas. Los testigos se prepararon de la misma manera pero sin agregar extracto alguno. Se utilizaron larvas de 3er. cstadío, las larvas de Culex tenían una edad de cinco días y un peso promedio de 1.6 mg. Las larvas de Aedes tenían una edad de cuatro días y un peso de 1.5 mg al inicio de las pruebas. Las cuentas de mortalidad se llevaron a cabo cada 0.5, 1, 4, 8, 12, 24, 48 y 72 horas; los resultados se sometieron a Análisis Pro bit ( Ignoffo, 1981; Tyrrell, 1979). RESULTADOS La duración de los ciclos biolégicos de las colonias de mosquitos obtenidas, no difiere de los mencionados por James and Harwood ( 1969). Sin embargo, se obtuvieron los siguientes pesos: Para A e des aegpyt, las larvas de 4o. estadía registraron un peso de 3.01 mg, los adultos pesaron 2.52 mg (hembras) y 1.71 mg (machos). Las larvas de 4o. estadía de Culex pipiens var. quinquefasciatus pesaron 3.56 mg y los adultos 2.71 (hembras) y 1.80 mg (machos). De los extractos probados, sólo IPS-78 mostró el efecto de "Aniquilación Rápida" pues desde los treinta minutos se observó intoxicación y muerte, además con dosis de 1 mg/1 se obtuvo una mortalidad superior al 97%, presentando una LCso de 0.28 mg/1 contra Aedes aegypti y 0.38 mg/l contra Culex. GM-1 y GM-7 sí fueron tóxicas para ambos tipos de mosquitos (aunque en concentraciones muy bajas). GM-1 en concentraciones de 100 mg/1 mostró una mortalidad de 9.33% y una LCso de 1410 mg/1 contra Aedes; una mortalidad de 38.66% y una LCso de 316 mg/1 contra Culex. GM-7 también en concentraciones de 100 mg/1 mostró una mortalidad de sólo 2.66% contra Ardn (no siendo posible calcular con ectos datos una LC 50 adecuada), en cambio contra Culex mostró una mortalidad de 42.66% y una LC 50 de mg/1. Tanto GM-1 y GM-7 mostraron síntomas de intoxicación después de cuatro horas de exposición. El único extracto que no tuvo efecto alguno en ninguna concentración fue GM-13. CoNCLUSIONES Y DiscusiÓN Las colonias de mosquitos establecidas no difieren de lo mencionado en la literatura (Hunter, 1973; Ikeshoji, 1970; James y Harwood, 1969) en cuanto a comportamiento, morfología o ciclo biolégico, pues requirieron de una temperatura de e y una humedad relativa de 70-90%, además tanto Aedes aegypti como Culex pipiens var. quinquefasriatus conservaron su costumbre de alimentarse de sangre humana y de ave respectivamente. Los ex- 79

6 tractos GM-1, GM-7 y GM-13 de Baállus thuringiensis no son adecuados para el control biológico de mosquitos, pues debido a su baja toxicidad no son competentes con IPS-78 ni con los demás formulados comerciales de B. thuringiensis var. israeliensis tales como R (Lab. Roger Bellon de Francia) y ( Lab. Abbott de E. U.). Generalmente los extractos de B. thuringiensis han sido más tóxicas para Aedes aegypti que para cualquier otro mosquito, sin embargo, por alguna razón los extractos GM-1 y GM-7 fueron menos tóxicos para Aedes que para Culex. Microscópicamente no se observó ninguna diferencia entre las larvas muertas por el standard 1 PS-78 y los extractos probados, pues ambos mostraron síntomas de "Enfermedad Lechosa". Probablemente los factores que más influyeron fueron: toxicidad del extracto, susceptibilidad de las larvas así como la alimentación y densidad de las larvas. Finalmente, sería interesante probar estos extractos contra diversos Lepidópteros (Trichoplusia ni, H eliothis virescens) ya que generalmente los extractos que actúan contra mosquitos no son tóxicos contra Lepidópteros y viceversa. También, es recomendable que se prueben algunos extractos de Bacillus thuringiensis contra diferentes Orthópteros y Dictiópteros como saltamontes y cucarachas ya que ambos constituyen plagas de tipo agrícola y doméstico respectivamente. LITERATURA CITADA Au ARSHAD, BAGGS D. RICHARD & P.]. STEWART Suceptibility of Sorne Florida Chironomids and Mosquitoes to Various Formulations of Bacillus thuringiensis var. israeliensis. J. Econ. Entorno[. 74: CoLVARD, ].] El Comportamiento Alimenticio de los Mosquitos. Investigación y Ciencia, Prensa Científica, S.A. Barcelona, España pp DADD, R.H. & ].E. KLEINJAN Phagostimulant Effects of Simpk Nutrients on Larval Culex pipiens. Ann Entorno[. Soc. Am. 75: FONTAINE, R.E Mosquito Control Research: Annua[ Report. University of California, Riverside Cal. HuNTER, III, G.W. 197:~. Manual de Medicina Tropical. :>a. Edición Español. Prensa Médica Mexicana pp NOFFO, C.M., T.L. Couc.H, C. GARCÍA & M.]. KROHA, Relative Activity of Bacillus thuringiensis var. kurstaki and B. thuringie.nsis var. isr>aeliensis against larvae of Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus, Trichoplusia ni, Heliothis zea and H. virescens. J. E con. Entorno[. 63: lkeshoji, T. & M.S. MmRA Overcrowding Factors of Mosquito Larvae. f. Econ. Entorno[. 63: ]AMES M.T. & R.F. HARWOOIJ Herm's Medic,al Entomology. 6th Edition. Mac millan Publishing Co. pp MIURA T., TAKAHASHI R.M. & III MILLIGAN Effects of the Bacteria] Mosquito Larvicide Bacillus thuringiensis serotype H-14 on S.-Iected Aquatic Organisms. Mosq. News 40: MuLLA M.S Rearing Techniques for Aedes aegrpti. Dept. of Entomology. University of California, Riversidt', Cal. 80

7 PARKER B.M Temperature and Salinity as Factors influencing the Size and Reproductivity of Aedes dorsalis. Ann. Entorno!. Soc. Am. 75: TYRRELL D.J., L.l. DAvmsoN, BuLLA ]R. L.A. 1t W.A. RAMOSKA Toxicity of Parasporal Crystals of Bacillus thuringiensis var. israeliensis to Mosquitoes. Appl. Environ. Microbio!. 38: Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases. TDR Newsletter No. 20: