UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS INSTITUTO DE CIENCIA ANIMAL

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1 UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS INSTITUTO DE CIENCIA ANIMAL DETERMINACIÓN DEL TIPO DE ANESTRO MEDIANTE ECOGRAFÍA OVÁRICA Y DEL DESEMPEÑO REPRODUCTIVO FRENTE A DIVERSAS OPCIONES TERAPÉUTICAS EN VACAS LECHERAS A PASTOREO Memoria de Título presentada como parte de los requisitos para optar al TÍTULO DE MÉDICO VETERINARIO DIEGO AQUILES POBLETE CORNEJO VALDIVIA CHILE 2012

2 PROFESOR PATROCINANTE Firma Nombre Claudia Letelier Velásquez PROFESOR COPATROCINANTE Firma Nombre Marcelo Ratto Fuster PROFESORES CALIFICADORES Firma Nombre Nestor Tadich Babaic Firma Nombre Viviana Bustos Salgado FECHA DE APROBACIÓN: 03 de Diciembre de 2012

3 ÍNDICE Capítulos Página 1. RESUMEN 1 2. SUMMARY INTRODUCCIÓN 3 4. MATERIAL Y MÉTODOS RESULTADOS DISCUSIÓN REFERENCIAS AGRADECIMIENTOS 21

4 1 1. RESUMEN El presente estudio describe en animales que no han presentado actividad estral luego de los días de espera voluntario del predio, el tipo de anestro mediante las estructuras ováricas presentes en el ovario y evalúa la respuesta reproductiva a los tratamientos hormonales dependiendo del tipo de anestro clasificado. Cuarenta y tres hembras bovinas Frisón negro, las cuales no presentaban estro luego de un periodo de espera voluntario de 50 días, con un promedio de 78±15 días fueron utilizadas para este estudio. Para determinar la causa del anestro, fueron sometidas a un examen ultrasonográfico para determinar CL y folículos, utilizando su tamaño como base de análisis para determinar la condición de anovulación. Para tratar la condición de anestro se aplicaron 6 tratamientos hormonales a los cuales se les evaluó la tasa de preñez. Los tratamientos aplicados fueron los mismos para vacas anovulatorias y con CL, con la excepción de que PG no se utilizo en anovulatorias, ni Ovsynch en vacas con presencia de CL. Grupo 1: Ovsynch. Grupo 2: Ovsynch/DIP en base a Ovsynch, con la inserción de dispositivo intravaginal de progesterona por un periodo de 7 días. Grupo 3: Ovsynch/DIP-ECP base Ovsynch, con la aplicación de dispositivo intravaginal de progesterona y remplazando la aplicación de GnRH el último día por 2mg de Ciprionato de estradiol. Grupo 4: DIP, dispositivo intravaginal de progesterona. Grupo 5: GnRH (100µg de Gonadorelina). Grupo 6: PG (5 mg de Dinoprost). Los resultados indican que el 63% presentó una condición de anovulación, de los cuales el 63% corresponde a anovulación de tipo II, el 30% al tipo III y solo un 7% a tipo I. Los tratamientos que utilizaron progesterona presentaron en general una mejor tasa de preñez versus los que no la utilizaron (44% sobre 28%), alcanzándose valores en el Grupo DIP de 67%, esta respuesta fue mayor cuando se aplicó en animales con anovulación tipo II. Animales con presencia de CL al examen ultrasonográfico, los cuales fueron considerados en falso anestro, se presentaron en un 37%, logrando una tasa de preñez de un 67% cuando se les trato con progesterona. Se concluye que al momento del examen ultrasonográfico existe una importante cantidad de animales en falso anestro. En los animales determinados en condición de anovulación, el tipo II es el que presenta mayor porcentaje. Los animales tratados con el dispositivo intravaginal de progesterona presentan una mejora en las tasas de preñez, cuando es utilizado para el tratamiento de animales anovulatorios y para la sincronización de vacas cíclicas. Palabras clave: anestro, ultrasonografía, estructuras ováricas, tratamientos hormonales.

5 2 2. SUMMARY CLASSIFICATION OF ANESTRUS USING OVARIAN ULTRASONOGRAPHY AND EVALUATION OF THE EFFECT OF HORMONAL TREATMENT ON REPRODUCTIVE PERFORMANCE IN GRAZING DAIRY COWS The present study describes cows that have not showed estrus after 50 day the voluntary waiting period, classifies anestrus according to the structures present in the ovary and studies the reproductive answer to the hormonal treatment received in each kind of anestrus. Forty-three Frison cows, who had not presented estrous after a 50 day voluntary waiting period, with an average of 78 days (44-110), were considered for this study. In order to determine the cause of the anestrus, they were submitted for ultrasonographical examination to determine the ovarian structures, CL and folicules, using the structure size as parameter to determine the condition of anovulation. To treat the condition of anestrus 6 different hormonal treatments were applied and pregnancy rates were studied. The treatment for anovulatory cows and cows with CL were the same, with the exception that PG was not used in anovulatory cows, nor Ovsynch in cows with the presence of CL. Group 1: Ovsynch. Group 2:Ovsynch/DIP based on Ovsynch, with the insertion of progesterone in an intravaginal device during 7 days. Group 3: Ovsynch/DIP-ECP based on Ovsynch, with the application of a progesterone intravaginal device, replacing the GnRh application the last day with 2mg of Estradiol Cypionate. Group 4: DIP, intravaginal progesterone device. Group 5: GnRH (100µg of Gonadoreline). Grupo 6: PG (5 mg of Dinoprost). The results showed that 63% presented a condition of anovulation, from those 63% corresponded to type II anovulation, 30% to type III and only 7% to type I. The treatment that included progesterone presented a higher pregnancy rate versus the ones who did not (44% over 28%), reaching values of 67% in the DIP Group, this answer was higher when applied on animals with type II anovulation. The same was the case with animals who presented luteal tissue in the ultrasonographical examination (37%), which was considered as false anestrus, they all presented CL at the ultrasonographical examination and when treatments with progesterone were applied they reached a 67% pregnancy rate. It can be concluded that there is a large number of animals with false anestrus at the moment of the ultrasonographical examination, due to the presence of luteal tissue. In the anovulatory animals, the majority presented type II anovulation. The progesterone intravaginal device improves the pregnancy rate when applied as treatment for anovulatory animals and for synchronization for cyclic cows. Keywords: anestrus, ultrasonography, ovarian structures, hormonal treatments.

6 3 3. INTRODUCCIÓN 3.1. ANTECEDENTES GENERALES SOBRE LA INDUSTRIA LECHERA La intensificación de los sistemas productivos ha permitido una mayor producción lechera. Sin embargo, para alcanzar estos niveles, las hembras requieren de mayores aportes nutritivos, los que no siempre son entregados en calidad ni en cantidad. Esto tiene un efecto sobre la fertilidad del plantel observándose una disminución de la fertilidad a medida que las condiciones se hacen más intensivas, la cual se manifiesta clínicamente en forma de anestro, lo que induce a ciclos irregulares e ineficientes que disminuyen la eficiencia en la producción con importantes consecuencias desde el punto de vista económico (Rendel 1997) FISIOLOGÍA DEL POSTPARTO Después del parto la estrategia reproductiva de la vaca lechera es el restablecimiento, tanto de su aparato reproductivo como de su sistema endocrino. En vacas de leche este intervalo desde el parto hasta la primera ovulación es por lo general de 19 a 22 días. Estos cambios comienzan con un incremento de la hormona folículo estimulante (FSH), resultando en la emergencia de la primera onda folicular, disponiendo así de 5 a 10 folículos para su desarrollo, esto se traduce como el inicio de una onda folicular, donde el proceso de selección determina un folículo dominante. Durante el crecimiento de este folículo dominante se produce un aumento de estrógeno e inhibina, lo que provoca un efecto de reacción negativa en la liberación de FSH, produciéndose la atresia de los folículos pequeños. Es así que bajo la influencia de la hormona luteinizante (LH), el folículo dominante madura. Cuando los estrógenos producidos por el folículo dominante alcanzan un nivel límite, se desencadena la liberación de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH) a nivel hipotalámico, produciendo un pick de LH responsable de la ovulación en el folículo maduro, la que es seguida por la formación de un cuerpo lúteo (CL). La primera ovulación postparto es frecuentemente asociada con una ausencia de comportamiento estral y una fase lútea de corta duración. Este CL de corta duración es consecuencia de la interacción del útero, el CL y probablemente el folículo preovulatorio. Pulsos prematuros de prostaglandina (PGF2α) provenientes del útero, provocan un inadecuado desarrollo del CL, siendo la principal causa de la corta duración de este. Animales con cuerpos lúteos de corta duración, baja expresión de los signos de estro y periodos anovulatorios de variable duración, son observados en el postparto de algunas vacas, representando un problema reproductivo dentro de nuestro rebaño lechero (Rhodes y col 2003) ANESTRO POSTPARTO El período posparto juega un papel fundamental en la eficiencia reproductiva del rebaño. Se ha sugerido que en los rebaños lecheros de alto rendimiento, existe una mayor incidencia de anestro,

7 4 debido a una división cada vez mayor de energía para la producción de leche, ya que se produce un retraso en la reanudación de la actividad ovárica lo que puede resultar en anestro. Sin embargo, factores como la ingesta de energía limitada, la disminución de las reservas corporales después del parto y las enfermedades, también pueden retrasar el retorno a la ciclicidad (Peter y col 2009). La duración del anestro postparto no está determinada por la emergencia de las ondas foliculares, sino más bien por la desviación folicular y/o el destino del folículo dominante. Bajo condiciones óptimas, hay una desviación en el crecimiento folicular, la selección de un folículo dominante, su crecimiento a la madurez, ovulación, formación de un CL y su posterior luteólisis, dando como resultado el restablecimiento de la actividad ovárica cíclica, como una oportunidad para el logro de la preñez. El incumplimiento de cualquiera de estos procesos prolonga el anestro postparto (Peter y col 2009). Históricamente, el anestro se clasifica en términos generales en fisiológicos y patológicos, con la siguiente representación del tipo patológico: ovarios inactivos, donde se presenta anovulación y la ausencia de un CL y CL persistente donde no ocurre regresión del CL. Es importante hacer la diferencia entre anestros fisiológicos y patológicos, y los que se producen por malos manejos del rebaño, donde en esta ultima la alta producción de las vacas lecheras va a producir inherentemente bajas expresiones de los signos de estro, particularmente durante el postparto temprano, con estros que no son observados, dando como resultado animales que son determinados en anestro, no estándolo (falso anestro), los que pueden incrementar la incidencia de anestro en el plantel lechero (Peter y col 2009). La evaluación del crecimiento folicular a través del ultrasonido junto con la medición de las hormonas reproductivas circulantes, llevo a la clasificación de la dinámica folicular en tres eventos principales: la emergencia, determinada cuando el primer folículo alcanza un tamaño 4mm, la desviación, definida como el comienzo de grandes diferencias en las tasas de crecimiento del folículo más grande y del folículo que lo sigue, sin que estos alcancen un tamaño ovulatorio, y la dominancia, donde el folículo alcanza un tamaño ovulatorio variable de 10 a 20 mm. La clasificación de la condición anovulatoria en estos tres puntos críticos, entrega un diagnostico racional, para una correcta elección del tratamiento según la condición fisiológica existente (Wiltbank y col 2002). En este trabajo, se clasificará el anestro en el contexto de la dinámica folicular ovárica descrito por Wiltbank y col (2002), donde según los distintos cambios morfológicos que deberían ocurrir a nivel del ovario, con las estructuras que acompañan el ciclo y el crecimiento en ondas de los folículos, esperando eventos fisiológicos normales como son: emergencia folicular, folículos hasta la desviación pero sin tamaño ovulatorio y folículos con tamaño ovulatorio, donde al verse interrumpidos cualquiera de estos eventos fisiológicos, los cuales no dan como resultado la ovulación, se pueden clasificar las formas de anovulación en tres tipos, existiendo una cuarta que se produce por una fase luteal prolongada. Anovulación con crecimiento folicular solo hasta emergencia (Tipo I): se observa en animales sujetos a una severa restricción nutricional durante el postparto, esta condición

8 5 resulta en ausencia de folículos >8 mm y está asociado a una disminución de FSH circulante, lo que provocaría que los folículos solo lleguen a tamaño de emergencia. Anovulación con crecimiento folicular hasta la desviación pero sin tamaño ovulatorio (Tipo II): Es una de las causas de anovulación que con mayor frecuencia son reportadas. Esta condición suele ocurrir en todas las vacas durante el periodo prepuberal y comúnmente en el posparto cuando se encuentran en el periodo de producción lechera y se encontraría asociado con una baja cantidad de estrógeno circulante, con lo cual se observarían folículos con diámetro > 8 mm no llegando a un tamaño ovulatorio. Anovulación con crecimiento folicular hasta tamaño ovulatorio o gran tamaño folicular (quiste folicular) (Tipo III): aquí ocurre desviación, crecimiento y establecimiento de un folículo dominante que no ovula y se vuelve persistente; esto puede ser debido a una falla en la sensibilidad del hipotálamo a los estrógenos o una respuesta alterada del folículo a las hormonas hipofisarias (FSH y LH) mediada por las hormonas metabólicas (Insulina, IGF- I). En un porcentaje de casos, estos folículos pueden transformarse en quísticos, alcanzando un gran tamaño folicular (25mm). Esta categoría de anovulación posee una variedad de condiciones fisiológicas y pueden ser asociadas con una ausencia o exceso de comportamiento sexual. Anovulación en presencia de tejido luteal (Tipo IV): Este tipo de anovulación se produce por una fase luteal prolongada. Estas vacas tienen celos normales, ovulación y la formación de un CL, pero la función lútea se prolonga debido a que no ocurre regresión del CL. Un factor que contribuye, es la falta de un folículo dominante estrogénico al tiempo de la regresión del CL. En este sentido, se piensa que el estradiol proveniente de un folículo dominante induce la formación de receptores uterinos para oxitocina, los que llevan a una secreción pulsátil de PGF2α provocando de esta manera la regresión del CL. Algunas de las causas de este tipo de anovulación son infecciones uterinas, distocias, enfermedades durante el primer mes de lactancia, el estrés por calor, y tal vez la ovulación poco después del parto OPCIONES DE INTERVENCIÓN Para reducir el impacto del anestro postparto sobre el rendimiento económico de las explotaciones bovinas comerciales, requiere la implementación de un riguroso programa de control reproductivo, que garantice la identificación rutinaria de las patologías que con mayor frecuencia afectan la función reproductiva de las hembras y que retardan el reinicio postparto de su ciclicidad ovárica. La evaluación de la condición corporal, suplementación alimenticia desde el periodo pre-parto, la implementación del servicio temprano, el uso del efecto bioestimulador del macho, y la aplicación de tratamientos hormonales, han sido utilizados con resultados alentadores en la actualidad y son aplicados con éxito como estrategia para controlar el anestro (Perea y col 2003).

9 Nutrición. Una de las causas más comunes de anestro en el ganado lechero es producida por los prolongados periodos de balance energético negativo durante el postparto. En este periodo existe una disminución en el consumo de alimento, el cual coincide con un incremento en la producción lechera cuando se necesita una mayor cantidad de nutrientes. Debido a que la mayor proporción de la dieta es a base de forraje, los cuales poseen una baja cantidad de energía, producen inevitablemente una disminución en el peso corporal, impactando negativamente en el balance energético del animal. El manejo clínico del anestro en animales con balance energético negativo, pasa por mejorar la entrega de nutrientes y la administración de raciones con alta palatabilidad, particularmente en el periodo del periparto donde ocurre una disminución en el consumo. Vacas en anestro por balance energético negativo no son candidatas para una intervención hormonal, debido a que el retorno normal del estro se producirá cuando se recupere la condición corporal adecuada (Younquist 1997) Bioestimulación. Una vez que los toros han sido seleccionados para su uso en la reproducción, estos pueden ser usados sueltos en un grupo de hembras o bien ser utilizados para la reproducción con hembras seleccionadas. Se ha visto que el contacto de vacas con toros en el postparto estimula el reinicio de la actividad ovárica, produciendo mayor incidencia de estros. Así vacas que reciben bioestimulación presentan un anestro más corto en el postparto, utilizándose además como una herramienta muy conveniente en situaciones donde no es posible realizar una buena detección de celos (Madrigal y col 2001) Tratamientos Hormonales. La intervención hormonal es una de las alternativas más usadas para estimular al ovario a retornar a la ciclicidad. Las hormonas usadas para el control farmacológico del ciclo estral son idénticas a los análogos de las hormonas reproductivas encontradas en el hipotálamo (GnRH), ovario (estradiol y progesterona), y útero (PGF2α) de la vaca (Lucy 2005) Hormona liberadora de gonadotrofina (GnRH). La GnRH es una hormona peptídica (decapéptido) sintetizada por el hipotálamo y que ejerce su acción biológica a nivel hipofisiario, estimulando la secreción de LH y FSH. La administración exógena de GnRH promueve la actividad ovárica y la ovulación en vacas en anestro posparto. La respuesta al tratamiento está condicionada por el tiempo posparto y el desarrollo folicular. La administración de GnRH induce la descarga preovulatoria de LH y ovulación en vacas lecheras entre los 10 a 18 días posparto. Sumado a esto, es necesaria la presencia de un folículo dominante (> 10mm) capaz de responder a la descarga de LH. Este pico de LH provoca la elevación rápida de esteroides gonadales (estradiol y progesterona), y de prostaglandina en el líquido folicular, desempeñando esta última un rol primordial en los mecanismos íntimos de la ovulación (Kim y col 2005) Estradiol. El estradiol administrado en la dosis apropiada se puede usar para sincronizar una onda folicular en el ganado bovino. Al existir una alta concentración de progesterona (ya sea de fuentes endógenas o exógenas), el estradiol produce una reducción en la secreción de LH, provocando la atresia del folículo dominante, causando de esta manera la emergencia de una nueva onda folicular. Cuando existe una baja concentración de progesterona circulante, el estradiol provoca la liberación de GnRH, la cual producirá un pico de LH que puede conducir a la ovulación y luteinización del folículo dominante en algunos animales. De esta manera, el estradiol es similar, aunque algo menos eficaz, a la inyección de GnRH utilizado para la sincronización de

10 7 la onda folicular. El estradiol también puede tener una acción directa sobre el folículo dominante causando su atresia y, al mismo tiempo, suprimir la síntesis de FSH y su secreción. El intervalo de aparición de un grupo de folículos nuevos después del tratamiento con estradiol, depende de la dosis y el tiempo de tratamiento en relación con la emergencia del folículo dominante. El estradiol también causa regresión del CL cuando se inyecta al comienzo del ciclo estral (Lucy y col 2004) Prostaglandinas. La administración de prostaglandinas es un método eficaz para el tratamiento de vacas que poseen un CL persistente o un quiste luteal. En el caso del CL persistente prostaglandinas causa una rápida regresión del CL, con una rápida declinación en la producción de progesterona. La luteólisis es comúnmente seguida por un desarrollo de folículos ováricos y celo con una ovulación normal. Para el tratamiento del quiste luteal prostaglandinas es el método de elección, induciendo la regresión del quiste, ocurriendo el estro posterior a los 8 días de haber aplicado el tratamiento (Peter y col 2009) Ovsynch. El programa Ovsynch fue concebido en Norteamérica como un medio de minimizar la detección de celo y sincronizar a las vacas, utilizándose además para dar tratamiento a las vacas en anestro en Sudamérica y Nueva Zelanda. Consiste en una secuencia de inyecciones de GnRH/PGF2α/GnRH durante 9 días. La primera inyección de GnRH se administra en una etapa al azar en el ciclo de anestro, causando tanto la luteinización o la ovulación del folículo más grande, en aproximadamente el 85 % de las vacas. La administración de PGF2α 7 días después, provoca la regresión del CL o bien del folículo luteinizado inducido por la GnRH. Se forma así un nuevo folículo dominante que está listo para la ovulación al momento de la administración de la segunda GnRH, administrada en el día 9. La inseminación a tiempo fijo (IATF) es llevada a cabo normalmente 16 horas después de la última GnRH (Keskin y col 2011) Progesterona. La progesterona es una hormona secretada por el CL, la placenta y por la glándula suprarrenal, su secreción es estimulada principalmente por la hormona luteinizante (LH), con la función de preparar el endometrio para la implantación del embrión y el mantenimiento de la preñez (Flores 2005). El sistema de sincronización de estro que emplea el uso del dispositivo intravaginal de progesterona (DIP) tiene tres ventajas sobre otros sistemas que no usan progesterona. Primero, mantiene una concentración de progesterona en sangre a niveles de 1 ng/ml lo que suprime los pulsos de LH y el comportamiento estral. Así, la progesterona por sí sola, es un agente de sincronización altamente eficaz en vacas cíclicas que han regresado su CL. La segunda gran ventaja es que en vacas que se encuentran en anestro existe una gran respuesta cuando esta es usada. La exposición a niveles elevados de Progesterona es decisiva para la expresión normal del celo y para una fase luteal normal. La aplicación de progesterona exógena en vacas en anestro, provoca un descenso de LH inicialmente, para posteriormente incrementar los pulsos de LH. Este aumento en los pulsos de LH incrementa el desarrollo del folículo dominante. Al momento de remover la progesterona, esta es seguida por el estro, ovulación, y un desarrollo normal de un CL en una gran cantidad de vacas tratadas. La exposición a progesterona exógena seguida por su declinación (priming de progesterona), parece ser necesaria para una diferenciación normal de las células de la granulosa y el desarrollo post ovulatorio del CL en vacas con anestro post parto. El tratamiento de ovarios quísticos es la tercera ventaja de la suplementación con progesterona. Aumentos anormales de pulsos de LH, en ausencia de un pico de LH, es la característica

11 8 endocrina que aparece en esta enfermedad. La suplementación con progesterona disminuye los pulsos de LH en vacas quísticas. El descenso en los pulsos de LH después del tratamiento con progesterona es seguida por la regresión del folículo quístico. El desarrollo de un nuevo folículo dominante es normal y la ovulación de este ocurre cuando la progesterona es retirada (Lucy y col 2004). 3.5 OBJETIVOS Objetivo general: Caracterizar el tipo de anestro que afecta a vacas lecheras a pastoreo en supuesta situación de anestro y evaluar la respuesta reproductiva a la aplicación de diversos tratamientos hormonales para resolverlo. Objetivos específicos: 1) Evaluación y monitoreo de estructuras ováricas presentes al examen ultrasonográfico, para determinar la causa del posible anestro. 2) Caracterizar la respuesta reproductiva a los tratamientos hormonales aplicados dependiendo de las estructuras ováricas presentes.

12 9 4. MATERIAL Y MÉTODOS El estudio fue realizado con 43 hembra bovinas Frisón negro, con un promedio de 3.3 años de edad, 2,2 lactancias y con una producción láctea promedio de 18,5lt. Los animales pertenecían a las dos estaciones experimentales dependientes de la UACH, Vista Alegre y Santa Rosa, las cuales se ubican colindantes en la salida norte de la ciudad de Valdivia a 14 km de esta. Los animales posterior a un periodo de espera voluntario de 50 días, fueron determinadas en anestro por el personal de lechería, existiendo en cada predio una persona que insemina, con semen de diferentes toros. A los 43 animales diagnosticados en anestro se les sometió a un examen ultrasonográfico, el cual fue realizado por el médico veterinario de la UACH encargado de ambos predios. Este examen fue realizado con un ecógrafo Aloka SSD-550 con transductor lineal, de uso transrectal de 7,5 Mhz de frecuencia, para determinar la presencia y tamaño de CL y folículos. Esta información fue registrada en una ficha que contenía la fecha del examen, número del animal, estructuras presentes y tratamiento utilizado para cada animal. Además fue necesario utilizar el cuaderno de registro reproductivo del predio, donde se obtuvo información de la fecha de partos, número de inseminaciones, celos y preñez. Se utilizo la ficha y el cuaderno de registro reproductivo como base de análisis para el estudio actual, el cual es de tipo descriptivo, donde se tabulo la información, considerando para cada animal el tipo y tamaño de la estructura presente y con ello se definió el tipo de anestro de estos animales, considerando a los que presentaron CL a la observación como en falso anestro, revisando los registros de la vaca al examen posparto, para descartar que ese CL se mantuviera por patologías uterinas, además se tomo atención a los hallazgos externos que podrían acusar esta situación durante el examen ultrasonográfico. Los animales que no presentaron tejido luteal al examen ultrasonográfico fueron considerados en una condición de anovulación, asignándose estos a un tipo de anestro según la clasificación de Wiltbank y col (2002) considerando tres clasificaciones de anovulación dependiendo del diámetro folicular al examen ultrasonográfico. El anestro tipo I: fueron aquellas vacas que presentaban folículos que se encontraban solo hasta emergencia ( 9mm), tipo II: fueron aquellos animales que presentaban folículos con tamaños alrededor de la desviación ( 10mm - 13mm) y tipo III: fueron aquellas vacas con folículos con tamaño ovulatorio ( 14mm), considerándose dentro de este grupo los folículos 20mm como quísticos. Posterior al examen ecográfico, a cada animal dependiendo de las estructuras ováricas presentes y según la apreciación del médico veterinario de terreno, se aplicara uno de los 6 tratamientos hormonales propuestos, formando así los 6 grupos que son analizados en este estudio.

13 10 Grupo 1: Llamado Ovsynch donde los animales recibieron una primera inyección de 100µg de Gonadorelina 1, un análogo de GnRH, vía intramuscular, seguida 7 días después por una inyección de 5 mg de Dinoprost trometamina 2, un análogo natural de PGF2α, vía intramuscular, para terminar 2 días después con una inyección de 100µg de Gonadorelina vía intramuscular, realizándose la inseminación entre las 24hrs posteriores a la ultima inyección. Grupo 2: Llamado Ovsynch/DIP donde los animales recibieron una primera inyección de 100µg de Gonadorelina vía intramuscular, junto con la aplicación del dispositivo intravaginal con 1,9gr de progesterona natural 3 durante 7 días. Posterior al retiro del dispositivo intravaginal se aplicaron 5 mg de Dinoprost trometamina vía intramuscular, seguida 2 días después por una inyección de 100µg de Gonadorelina vía intramuscular, realizándose la inseminación dentro de las 24hrs posteriores a la ultima inyección. Grupo 3: Llamado Ovsynch/DIP-ECP donde los animales recibieron una primera inyección de 100µg de Gonadorelina vía intramuscular, junto con la aplicación del dispositivo intravaginal con 1,9gr de progesterona natural durante 7 días. Posterior al retiro del dispositivo intravaginal se aplicaron 5 mg de Dinoprost trometamina vía intramuscular, seguida 2 días después por una inyección de 2mg de Ciprionato de estradiol 4 vía intramuscular, realizándose la inseminación artificial dentro de las 24hrs posteriores a la ultima inyección. Grupo 4: Llamado DIP donde los animales recibieron un dispositivo intravaginal con 1,9gr de progesterona natural por un periodo de 7 días. Posterior al retiro del dispositivo intravaginal, se realizó la inseminación de los animales en el momento en que fueron detectados en celo. Grupo 5: Llamado GnRH donde los animales recibieron 100µg de Gonadorelina vía intramuscular, realizándose la inseminación de los animales en el momento en que fueron detectados en celo. Grupo 6: Llamado PG donde los animales recibieron 5 mg de Dinoprost trometamina vía intramuscular, realizándose la inseminación de los animales en el momento en que fueron detectados en celo. Finalmente, se incluyó en la información si estos animales quedaron preñados al primer servicio posterior al tratamiento. 1 Ovalyse, Pfizer Australia. 2 Lutalyse, Pfizer Australia. 3 CIDR, Pfizer Australia. 4 ECP, Pfizer Australia.

14 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Se realizó un análisis descriptivo de los mapas ováricos de los animales determinados en anestro, realizado por el médico veterinario del predio, determinando diámetro folicular (mm) y diámetro máximo de CL (mm) al momento del tratamiento. La cantidad de hembras preñadas posterior al tratamiento se determinó mediante el uso de los registros reproductivos del predio. El análisis de las estructuras ováricas en los animales determinados en anestro, tratamientos y preñez al primer servicio, fueron analizados a través de promedios, rangos y desviación estándar.

15 12 5. RESULTADOS De los 43 animales que luego de 50 días no había presentado estro posterior al parto, el 63% presenta una condición de anovulación al examen ecográfico, el resto se encuentra con tejido luteal. La distribución de la condición anovulatoria de las vacas en anestro fue principalmente aquellas que presentaban folículos que alcanzan la desviación, con estructuras de 13±0,8mm, considerándose en anestro tipo II. La siguiente en importancia fue el grupo con anestro tipo III, donde los folículos alcanzan un tamaño ovulatorio, pero no logran ovular, con diámetros foliculares promedio de 18±2,6mm, de este grupo un 12,5% tienen folículos quísticos mayores a 20 mm y la menor presentación son el grupo de vacas en anovulación tipo I, donde solo se presenta un 7% de anovulaciones, donde los folículos alcanzan un tamaño folicular promedio de 7±0,7mm de diámetro, no logrando sobrepasar la emergencia, tal y como se muestra en el cuadro 1. Cuadro 1. Numero y porcentaje de presentación de anovulaciones y tamaños foliculares promedio determinados mediante ultrasonografía en vacas diagnosticadas en anestro. Tipo de anovulación Nº Porcentaje de presentación Tamaño promedio del folículo de > diámetro(mm) I 2/27 7% 7±0,7 II 17/27 63% 13±0,8 III 8/27 30% 18±2,6 Con respecto a las vacas con presencia de CL, en el cuadro 2 se presenta la distribución de animales que se encontraba ciclando a pesar de que no fueron detectadas en estro. Estas vacas en falso anestro presentaban en promedio cuerpos lúteos de 20±4,6 mm, representando un 37% del total de animales que sobrepasaron los días de espera voluntario del predio. Cuadro 2. Número de animales en falso anestro y tamaño de CL promedio, observados en los 43 animales diagnosticados en anestro. Total de animales en anestro Nº Porcentaje de CL Tamaño promedio de CL (mm) / 43 37% 20 Se asignaron distintos tratamientos para la condición de anovulación de los animales, obteniendo resultados variables en cuanto a la tasa de preñez al primer servicio. Si solo se observa la preñez independiente del tipo de anovulación, se puede apreciar que el grupo DIP presento mayor porcentaje de preñez con un 67% (Fig. 3), logrando el valor más alto dentro de los 5 grupos que presentaron anovulación. En los grupos Ovsynch/DIP + ECP y GnRH se presentaron tasas de

16 13 preñez del 40 y 33% respectivamente. Se encontraron tasas de preñez similares en los grupos de Ovsynch/DIP y Ovsynch con 25 y 22% respectivamente. Tasa de preñez (%) 70 70% 60 60% 50 50% 40 40% 30 30% 20 20% 10% 00% DIP Ovsynch/DIP + ECP GnRH Ovsynch/DIP Ovsynch 67% 40% 33% 25% 22% Tratamientos Figura 1. Tasa de preñez al primer servicio según tratamiento aplicado, en el total de animales diagnosticados en anovulación. Ahora si se considera el tipo de anovulación y la respuesta al tratamiento, en el caso de los animales tratados con Ovsynch se obtuvo una tasa de preñez de un 25% y 20% en vacas con anovulación tipo II y III respectivamente. Al análisis de los mapas ováricos se puede observar que el tratamiento tuvo mejor respuesta cuando se aplicaba este tratamiento y en el ovario existía un folículo > 10mm de diámetro. En el grupo Ovsynch/DIP + ECP se obtuvo una tasa de preñez de 100% cuando se aplico en animales con anovulación tipo I, aunque solo un animal presento este tipo de anovulación, y un 25% cuando este tratamiento se aplico en vacas con anovulación tipo II. En el grupo que recibió el tratamiento Ovsynch/DIP se obtuvo un 33% de preñez al primer servicio en vacas con anovulación tipo II, por el contrario, cuando se aplico en animales con anovulación tipo III, no se logro preñez en ningún animal. Para el grupo en el que se aplico solo GnRH, la mayor tasa de preñez obtenida se logro en animales con anovulación tipo I logrando un 100% de preñez, aunque solo un animal presento este tipo de anovulación. En el grupo de animales en los que se utilizo un dispositivo intravaginal de progesterona, se obtuvo una mayor tasa de preñez al primer servicio cuando se administro en animales con anovulación tipo II, logrando inclusive un 80% de preñez, no así cuando se aplico en vacas con anovulación tipo III en que no se registro ningún animal preñado, datos presentados en el cuadro 3. Cuadro 3. Tipo de anovulación y porcentaje de preñez al primer servicio, de acuerdo al tratamiento realizado. Ovsynch Tipo de anovulación Preñadas/Tratadas % de preñez I - - II 1/4 25% III 1/5 20%

17 14 Ovsynch/DIP+ECP Tipo de anovulación Preñadas/Tratadas % de preñez I 1/1 100% II 1/4 25% III - - Ovsynch/DIP Tipo de anovulación Preñadas/Tratadas % de preñez I - - II 1/3 33% III 0/1 0% GnRH Tipo de anovulación Preñadas/Tratadas % de preñez I 1/1 100% II 0/1 0% III 0/1 0% DIP Tipo de anovulación Preñadas/Tratadas % de preñez I - - II 4/5 80% III 0/1 0% Con respecto a la respuesta de las vacas cíclicas en falso anestro (n=16) y el tratamiento para lograr preñarlas, se puede observar que aquellas que fueron tratadas con el dispositivo intravaginal de progesterona, son las que logran una mayor tasa de preñez al primer servicio con un 67%, presentando en hembras preñadas cuerpos lúteos que alcanzan en promedio 23±2,54mm y en no preñadas 10mm de diámetro. En el grupo de vacas en que se intento sincronizar el celo mediante la lisis del CL con prostaglandinas, muestran tasas de preñez de un 38%, alcanzando en promedio diámetros de cuerpos lúteos de 25±5mm en preñadas y en no preñadas de 19±6,13mm de diámetro. En el caso de las 4 vacas tratadas con los protocolos en base a Ovsynch (0/4), presentaban en promedio CL de 20±6,12mm, no resultando ninguna vaca en gestación y cuando se aplico GnRH el único animal de este grupo no resulto gestante, en este caso el CL media 25mm.

18 15 6. DISCUSIÓN El presente estudio caracteriza la presentación de vacas que no mostraron signos de estro luego de los días de espera voluntario, permitiendo apreciar que un porcentaje importante (Cuadro 2) no están acíclicas y presentan tejido luteal, y el resto, presenta una condición de anovulación con distintos grados de complejidad, según el tamaño folicular que alcanzan, lo que permite apreciar la distribución de falsos anestros y anovulación en un plantel lechero tradicional a pastoreo observándose que en el caso de anovulación, esta corresponde a un 63% del rebaño considerado aparentemente en anestro y 37% a animales que se encontraban ciclando al momento del examen ultrasonográfico, esto último es similar a lo descrito por McDougall (2010) en donde animales alimentados a base de pradera, entre un 10 y 30% de las vacas en anestro presentaban CL. En un estudio realizado por McDougall y col (2005) en vacas que fueron diagnosticadas en anestro se obtuvo que un 17,4% presentaban CL posterior al examen ultrasonográfico. Posiblemente estas variaciones en los datos se pueda deber a una mala detección del celo y también a que vacas de alta producción de leche tienen de por sí una baja expresión de los signos de estro. Peter y col (2009) describen que en el manejo de los hatos lecheros modernos, la eficiencia de la detección de celo puede ser extremadamente pobre, lo que resultaría en una baja cantidad de vacas observadas en estro. Por lo tanto, la ovulación silenciosa (la falta de claros signos de estro) y estros no observados (baja eficiencia de detección de celo) puede aumentar la incidencia de anestro en presencia de un CL. En este estudio vacas que presentaron uno de los tres tipos de anovulación, la tipo II presentó la mayor cantidad de animales con un 63%. Cabe señalar que todas las vacas se encontraban en el postparto y en el periodo de producción láctea, en donde este tipo de anovulación es la que con mayor frecuencia es reportada. Wiltbank y col (2011) describen que anovulación tipo II es la que se presenta con mayor frecuencia, asociada principalmente a vacas en postparto que se encuentran en el periodo de producción láctea. Peter y col (2009) describen que este tipo de anovulación puede ser provocado por un balance energético negativo (BEN) el cual debe ser corregido con una dieta adecuada en el periodo seco, para así reducir el intervalo entre el parto y la primera ovulación. Probablemente debido a que los animales del estudio actual recibían una dieta a base de pastos, las necesidades energéticas de producción no estaban totalmente cubiertas, lo que provocaría que anovulación de tipo II se presente con mayor porcentaje, por lo cual para un correcto tratamiento de este tipo de anovulación deben primero estar satisfechas las exigencias energéticas de producción. Animales en anestro tipo III se presentaron en un 30%,con folículos entre 14 y 25mm siendo la segunda condición que obtuvo mayor frecuencia. Contrario a lo descrito por Gumen y col (2003) donde anovulación tipo III se presento con mayor frecuencia, con folículos entre 15 a 24mm de diámetro, representando un 58% del total de animales en anovulación. En este tipo de anovulación es importante que exista un folículo que presente un tamaño que responda al estimulo de LH, es por eso que el diagnostico ecográfico realizado en el estudio actual, permitió determinar si el folículo presentaba el tamaño adecuado, para que al momento de la aplicación del tratamiento este ovule. Anovulación tipo I fue la que se presento en menor porcentaje (7%), similar a lo descrito por Peter y col (2009) donde se espera que esta condición ocurra en <10% de la población de vacas en postparto. Posiblemente los dos animales

19 16 del estudio actual que presentaron este tipo de anovulación (cuadro 3), se encontraban con algún tipo de desbalance nutricional, ya que una de las principales causas de este tipo de anovulación se debe a la desnutrición extrema, producto de un desbalance nutricional, lo que conlleva a un déficit de energía severa lo cual puede causar esta condición, provocando una falta de apoyo esencial de FSH y LH para sostener el crecimiento folicular y la dominancia. Al evaluar la tasa de preñez alcanzada en cada tratamiento aplicado según tipo de anovulación, se puede ver que Ovsynch, el cual se aplico en animales que presentaban anovulación tipo II y III, la tasa de preñez fue la más baja con un 22%. Similar a lo descrito por Rhodes y col (2003) donde se trataron con Ovsynch vacas anovulatorias tipo II y III, obteniendo una tasa de preñez de 21%. Por el contrario Gumen y col. (2003) utilizaron este mismo protocolo en vacas con anovulación tipo II y III, logrando una tasa de preñez de un 9%, la que describieron como baja en comparación con otros estudios. El tratamiento Ovsynch/DIP fue aplicado en animales que presentaban anovulación tipo II y III, obteniendo mejores resultados en la tasa de preñez en vacas con anovulación tipo II. Si se comparan las tasas de preñez obtenidas en el total de animales en anovulación cuando se aplicaron Ovsynch (22%) y Ovsynch/DIP (25%), este último posee una mayor tasa de preñez, lo que concuerda con un estudio realizado por Herlihy y col (2011) en el que se aplicaron dos protocolos de sincronización en animales que se encontraban en anestro, los cuales fueron Ovsynch y Ovsynch/CIDR, observándose que la adición de un dispositivo intravaginal de progesterona produce un aumento en las tasas de preñez, comparado con el mismo protocolo sin progesterona. Cuando Ovsynch se aplica en una etapa al azar del ciclo estral, se obtienen menores tasas de preñez debido a una variación en la respuesta de la primera y segunda GnRH en el folículo preovulatorio. En el estudio actual este protocolo fue iniciado en una etapa al azar del ciclo, lo que pudo afectar la respuesta del folículo preovulatorio, resultando en una baja tasa de preñez. Si comparamos en este estudio las tasas de preñez lograda entre Ovsynch, Ovsynch/DIP y Ovsynch/DIP+ECP podemos ver que este ultimo logro una mejor respuesta en la tasa de preñez, siendo aplicado principalmente en animales con anovulación tipo II. En un estudio realizado por Stevenson y col (2004) se trataron animales con Ovsynch+CIDR y Ovsynch/CIDR+ECP, obteniendo como resultado que la adición de Ciprionato de estradiol provoco un aumento en la tasa de preñez. Por otra parte Souza y col (2007) compararon el protocolo Ovsynch y Ovsynch+ECP donde se describe que la sustitución de estrógeno, por la última GnRH del protocolo Ovsynch, mejora las tasa de preñez. Ellos aplicaron este tratamiento en animales con distintos tamaños foliculares observando que la suplementación con estrógeno mejora las tasas de preñez en vacas con folículos 15 mm, no observando un aumento en las tasas de preñez cuando se aplica en vacas con folículos 13 mm. En el estudio actual se trataron con estrógeno animales con folículos 13mm, observando una mejora en las tasas de preñez. Sin embargo cuando existen folículos de mayor tamaño se produce una mayor concentración de estrógeno circulante, lo que aumenta los signos de estro en muchos animales. Debido a la alta producción lechera de las vacas se produce un aumento del metabolismo de estradiol. Este problema se exacerba durante Ovsynch debido a que la segunda inyección de GnRH causa la ovulación del folículo dominante antes de que se produzca el pick de estrógeno, produciendo una ausencia o reducción de la expresión de los signos de estro, provocada por una disminución de estrógeno circulante. En el estudio actual Ovsynch/DIP+ECP obtuvo una mayor tasa de preñez que el mismo protocolo sin estrógeno, probablemente debido a que los animales tratados con

20 17 estrógeno presentaron mejores signos de estro, resultando en una mejora en las tasas de preñez. Otro de los tratamientos utilizados para el tratamiento de vacas anovulatorias fue GnRH, el cual se aplico en tres animales y en los tres tipos de anovulación, resultando un animal preñado que presentaba anovulación tipo I. Sin embargo Bartolome y col (2003) y Peter y col. (2009) describen que en animales anovulatorios tratados con GnRH, se obtienen mejores resultados en las tasas de preñez cuando esta hormona es aplicada en animales con anovulación tipo III, produciendo la ovulación del folículo persistente. Otro protocolo utilizado en animales anovulatorios fue DIP, el cual se aplico en animales con anestro tipo II y III, logrando una mejor tasa de preñez aplicado en anovulación tipo II, lo que concuerda con el estudio realizado por Peter y col (2009) donde describen que el dispositivo intravaginal de progesterona produjo un retorno de la ciclicidad en animales tratados con anovulación tipo II. Esto se explica ya que en animales que presentan anovulación de tipo II existe una baja concentración de estrógeno circulante. Al suplementar con progesterona se produce al inicio, una disminución de LH, la cual es seguida por un incremento en la pulsatilidad y frecuencia de esta, asociado con un incremento de estradiol. Así la sensibilidad del hipotálamo al feedback negativo que provoca estradiol es reducido, resultando en un incremento en la estimulación de GnRH, produciendo el desarrollo de un folículo dominante el que posteriormente ovula. En el estudio actual DIP obtuvo la mayor tasa de preñez, lo que se debería a que este grupo estaba compuesto principalmente por animales con anovulación de tipo II, donde DIP en este tipo de anovulación, posee una buena respuesta en el retorno de la ciclicidad (Rhodes y col 2003). Dentro de los tratamientos utilizados en vacas con presencia de CL, el dispositivo intravaginal de progesterona obtuvo la mayor tasa de preñez con un 67%. Porcentaje que se acerca a lo descrito por McDougall y col (2005) en donde se trataron vacas que presentaban CL, con progesterona intravaginal logrando una tasa de preñez al primer servicio de un 62,3%. Ellos describen que las concentraciones de progesterona en la fase lútea anterior podrían influir de manera positiva en la tasa de preñez, a través de una mejora en la fase lútea posterior y por lo tanto, en un mejor crecimiento del embrión y en su supervivencia. Esto explicaría en el estudio actual porque progesterona resulto ser un protocolo de sincronización eficaz en las vacas que presentaron CL, provocando la regresión de este y una posterior respuesta positiva en la tasa de preñez. Otro de los tratamientos utilizados en animales que presentaron CL fue prostaglandina, siendo el método más utilizado para provocar la lisis del CL, poniendo en marcha un nuevo ciclo estral. Estos datos concuerdan con lo descrito por Peter y col (2009) donde prostaglandina es el método de elección para el tratamiento de vacas con presencia de CL. Sin embargo Hendricks y col (2006) describen que con la administración de prostaglandinas la efectividad en las tasas de preñez y de concepción logradas son bajas, debida probablemente a una mala detección de estros posterior a la aplicación de prostaglandinas. En un estudio realizado por Lucy y col (2004) animales tratados con prostaglandina poseen un intervalo entre la inyección de esta hormona y la demostración de estro muy variable, lo que dificulta que las tasas de preñez sean aceptables. Lo que explicaría porque en este trabajo si bien prostaglandinas fue el método de elección para terminar con la vida del CL, no logro la mayor tasa de preñez, probablemente debido a una deficiencia en la expresión de estro o en su detección.

21 CONCLUSIONES 1. No todas las vacas que no presentan celo posterior a los días de espera voluntario están acíclicas, un tercio de estos presenta una condición de falso anestro. 2. El anestro tipo II es la condición más frecuente dentro de las vacas anovulatorias. 3. Los tratamientos con progesterona, independiente de su condición de ciclicidad, logran mayores resultados de preñez.

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