Bistua: Revista de la Facultad de Ciencias Básicas ISSN: Universidad de Pamplona Colombia

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1 Bistua: Revista de la Facultad de Ciencias Básicas ISSN: Universidad de Pamplona Colombia Yáñez Rueda, Xiomara; Pérez, Omar Giovanny; Meza, Hernando Actividad larvicida del aceite esencial foliar de Eucaliptus globulus contra Aedes aegypti Linnaeus Bistua: Revista de la Facultad de Ciencias Básicas, vol. 8, núm. 1, enero-junio, 2010 Universidad de Pamplona Pamplona, Colombia Disponible en: Cómo citar el artículo Número completo Más información del artículo Página de la revista en redalyc.org Sistema de Información Científica Red de Revistas Científicas de América Latina, el Caribe, España y Portugal Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto

2 Revista Bistua Facultad de Ciencias Basicas Universidad de Pamplona Pamplona-Colombia Vol 8 (1),2010:71-77 Actividad larvicida del aceite esencial foliar de Eucaliptus globulus contra Aedes aegypti Linnaeus Larvicidal activity of essential oil isolated from Colombian Eucalyptus globulus against Aedes aegypti Linnaeus Xiomara Yáñez Rueda 1, Omar Giovanny Pérez 2,Hernando Meza 1 1 Grupo de Investigación en Productos Verdes (GPV), Universidad de Pamplona, Pamplona, Norte de Santander, Colombia. Correo electrónico: ipv@unipamplona.edu.co 2 Grupo de Investigación en Parasitología y Enfermedades Tropicales (GIEPATRI), Universidad de Pamplona, Pamplona, Norte de Santander, Colombia. RESUMEN La actividad larvicida del aceite esencial (AE) de las hojas secas de Eucaliptus globulus cultivado en la región de Chinácota, Norte de Santander (Colombia), contra la cepa de referencia Rockefeller del mosquito Aedes aegypti Linnaeus fue evaluada a nivel de laboratorio, teniendo en cuenta la metodología de la OMS. El AE fue obtenido por Hidrodestilación asistida por radiación de Microondas (HDMO) y sus componentes mayoritarios fueron analizados por Cromatografía de Gases de Alta Resolución (GCAR). Las larvas de cuarto estadio de A. aegypti resultaron susceptibles frente al AE en concentraciones de 100 ppm con una mortalidad del 100%. El análisis estadístico Probit-log de los bioensayos permitió determinar el valor de la dosis diagnóstica en % (348 ppm). La susceptibilidad de las larvas fue asociada con los componentes volátiles mayoritarios el 1,8-Cineol o Eucaliptol y el α- Pineno presentes en concentraciones del 82.38% y 8.69% respectivamente, seguidos de otros componentes como Bourboneno, Limoneno y Nerol, los cuales se supone poseen un efecto sinérgico. El AE de E. globulus se propone como una herramienta alternativa, ecológicamente compatible, en la estrategia de lucha integrada que se lleva a cabo en nuestra región tropical, para controlar este importante vector del dengue y la fiebre amarilla. PALABRAS CLAVES: Eucaliptus globulus, Larvicida, Aedes aegypti, eucaliptol, pineno, limoneno. *Para citar este articulo: Yáñez Rueda X, Giovanny Pérez O, Meza H. Actividad larvicida del aceite esencial foliar de Eucaliptus globulus contra Aedes aegypti Linnaeus. Bistua 2010;8(1):71:77 +Autor para el envio de correspondencia y la solicitud de separatas: Grupo de Investigación en Productos Verdes (GPV), Universidad de Pamplona, Pamplona, Norte de Santander, Colombia. Correo electrónico: ipv@unipamplona.edu.co ABSTRACT The aim of this work was to study the larvicidal activity of E. globulus essential oil against Aedes aegypti larvae. The essential oil was obtained by vapor extraction and their chemical composition was determined by gas chromatography coupled to mass spectroscopy. Bioassays were run with the essential oil pure and diluted. The results obtained showed that essential oil have larvicidal action, causing an almost instantaneous mortality. Eucaliptol, α-pinene, Limonene, Buorbuneno y Nerol were identified as the active principle responsible for the larvicidal action of E. globulus

3 essential oil, causing 100% larval mortality at the lowest tested concentration of 100ppm. These results suggest that the essential oil of E. globulus is promising as larvicide against A. aegypti and could be useful in the search of newer, more selective, and biodegradable larvicidal natural compounds to be used in official combat programs and at home. KEY WORDS: Eucalyptus globulus, larvicidal activity, Aedes aegypti, Eucalyptol, α-pinene, Limonene.

4 INTRODUCCIÓN La utilización de productos naturales como los aceites esenciales (AE) se ha incrementado en los últimos tiempos, en las áreas alimenticia, farmacéutica y cosmética, como agentes conservantes, antioxidantes, microbicidas e industriales en general. Colombia a pesar de su gran biodiversidad es un importador a gran escala de los AE [3]. Muchas especies vegetales poseen gran actividad biológica, no sólo contra los insectos, sino también contra otros organismos como ácaros, roedores, nematodos, bacterias, virus y hongos [9]. La familia Myrtaceae está compuesta aproximadamente por 133 géneros y unas 3900 especies, las cuales se distribuyen en su mayoría en las regiones tropicales y subtropicales de Australia y Suramérica. El género Eucaliptus abarca unas 300 variedades [16]. Es uno de los árboles de más rápido crecimiento en el mundo y alcanza a veces una altura de 100 m. Debido a que su enorme sistema de raíces absorbe vastas cantidades de agua, se ha plantado en áreas pantanosas infestadas de malaria para secar el suelo y purificar el aire. Tiene hojas altamente aromáticas de color verde-azul en forma de corazón cuando son jóvenes, y, largas y lanceoladas en su madurez. Cerca de 50 especies proveen un aceite valioso, con un aroma refrescante, penetrante y estimulante con reminiscencias medicinales [2]. El componente clave de las hojas de eucalipto es un aceite volátil conocido como Eucaliptol (1,8-Cineol) encontrado con la más alta proporción (70% como mínimo) [4]. Especies de la familia Myrtaceae han demostrado acción larvicida de su aceite esencial foliar contra A. aegypti agente transmisor del dengue clásico (DC), dengue hemorrágico y la fiebre amarilla [1]. Se ha demostrado que un extracto de aceite de eucalipto resulta eficaz en la protección contra distintos tipos de picaduras de insectos [8]. Como la mayoría de las especies del género Eucaliptus, las principales investigaciones de esta planta han sido dirigidas al estudio del AE de sus hojas, en la que también se observa la presencia de compuestos polifenólicos, una ß-dicetona antioxidante de cadena larga [12] y terpenoides aromáticos conocidos como los euglobales [4, 7]. De acuerdo con las reconocidas propiedades del Eucaliptol, se especula si este componente mayoritario, podría ser directamente responsable de la mortalidad de las larvas de A. aegypti o por el contrario requiere de la participación de los otros componentes minoritarios. Muchos de estos componentes menores tienen propiedades irritantes y son removidos por redestilación del aceite [7, 14]. El aumento de la resistencia al insecticida Abate (Temefós), considerado como el elemento clave en los programas de control químico del vector ha propiciado la aparición de nuevas epidemias de dengue y dengue hemorrágico en áreas tropicales, obligando a revisar la información sobre la situación de cría y desarrollo de A. aegypti, para retomar iniciativas globales de control [11]. En este trabajo, se ha evaluado el AE obtenido de las hojas secas de E. globulus, cultivado en la región de Chinácota (Norte de Santander), cuyos componentes químicos mayoritarios se consideran responsables frente a la susceptibilidad de las larvas de A. aegypti del cuarto estadio (cepa Rockefeller). Los resultados obtenidos son promisorios para desarrollar nuevos agentes antivectoriales de aceptación ecológica como estrategia de lucha integrada contra el principal vector del dengue y la fiebre amarilla.

5 MATERIALES Y MÉTODOS Obtención del Aceite Esencial (AE) Las hojas de E. globulus fueron recolectadas en la vereda Iscalá, del municipio de Chinácota, Norte de Santander (Fotografía 1). El municipio de Chinácota se encuentra ubicado en el valle que forma al bifurcarse poco antes de Pamplona, la Cordillera Oriental, a 7º 37 Latitud Norte y 72º36 Longitud Oeste, del Meridiano de Greenwich, tiene una extensión territorial de Km 2 y una altitud promedio de 1175 msnm (metros sobre el nivel del mar). Se encuentra en los pisos térmicos de templado a frío, con temperaturas que oscilan entre los 12ºC y los 22ºC [ La especie fue clasificada por el botánico Luis Roberto Sánchez, director del Herbario Regional Catatumbo-Sarare, de la Universidad de Pamplona. Las hojas se separaron manualmente de los tallos y se secaron al aire y a la sombra por 15 días. El AE fue extraído a partir de 300 gramos de material mediante el método de Hidrodestilación asistida por Microondas (HDMO), para lo cual se utilizó un microondas marca Samsumg, por 40 minutos y potencia del 70%. El rendimiento de AE se midió como ml de AE por 100g de hojas secas. FOTOGRAFÍA 1. Zona de recolección del eucalipto, en la Vereda Iscalá (Chinácota). (Fuente Los Autores).

6 Análisis Químico del Aceite Esencial (AE) La composición química de los aceites se determinó por la técnica de Cromatografía de Gases de Alta Resolución. Se tomaron 30 µl del aceite esencial y se disolvieron en 1 ml de diclorometano. En cada equipo, se inyectó 1 µl de la muestra anterior. Se estandarizaron las variables del método, como temperatura inicial y temperatura del horno. Se corrieron las muestras en las columnas HP-5 e INNOWAX, con el aceite esencial y con los patrones de hidrocarburos C-7 a C-32, para calcular los índices de Kováts (IK). Se confirmaron los componentes mayoritarios por espectrometría de masas, de acuerdo con la base de datos NYST Cepa Rockefeller de A. aegypti Se utilizaron larvas de la cepa de referencia Rockefeller considerada altamente susceptible, la cual ha sido mantenida y manipulada en el Laboratorio del Instituto de Salud de Norte de Santander, en Cúcuta (Colombia) por 30 años, sin presión de selección con insecticidas, por lo tanto, no ha sido expuesta, ni ha estado en contacto con otras especies, ni ambientes. Se considera una cepa de alta confiabilidad para la experimentación con insecticidas y potenciales plaguicidas (Fotografía 2). Bioensayos Teniendo en cuenta la metodología de la OMS se investigó la susceptibilidad de larvas de Aedes aegypti de cuarto estadio frente al AE de E. globulus. Partiendo de una concentración inicial de 200 ppm del AE, la cual causa el 100 % de mortalidad de las larvas, se realizaron los bioensayos preliminares utilizando 2 réplicas por cada concentración de AE con los controles correspondientes. Las concentraciones finales probadas para E. globulus fueron de 5 ppm, 15 ppm, 25 ppm, 50 ppm, 75 ppm y 100 ppm, con las que se realizaron bioensayos que contaron con 5 réplicas por concentración y sus respectivos controles. Los controles fueron tratados siguiendo la misma metodología, pero utilizando acetona como solvente. Posteriormente, se aplicó a los resultados el análisis estadístico Probit-log5 (concentración vs.mortalidad) para establecer la dosis diagnóstica del AE y las Concentraciones Letales del mismo (CL50 y CL99) [15].

7 FOTOGRAFÍA 2. Larvas entre tercer y cuarto estadio de la cepa Rockefeller de Aedes aegypti. (Fuente: Los autores).

8 Discusión de resultados y conclusiones El rendimiento de AE obtenido para las hojas secas de E. globulus fue del 1,33%. Por Cromatografía de Gases se identificaron más de una decena de componentes terpénicos como se muestra en el perfil cromatográfico del AE en la Figura 1. En la Tabla 1, se observan los componentes volátiles mayoritarios analizados. El 1,8-Cineol o Eucaliptol aparece como el componente de mayor proporción con 82.38%, seguido de α Pineno con 8.69%, Bourboneno con 2.25%, Limoneno con 1.35% y Nerol con1.22%. Las pruebas realizadas con concentraciones de 100 y 75 ppm del AE de E. globulus mostraron el 100% y el 73.2% respectivamente de mortalidad de las larvas de A. aegypti, según se observa en la Tabla 2. Con las concentraciones de 50, 25, 15 y 5 ppm el nivel de mortalidad resultó menor al 50%. En general, se observó que la concentración de los aceites y la mortalidad mantienen una tendencia a la proporcionalidad, lo que indica que a medida que decrece la concentración de AE, se observa la disminución en el porcentaje de mortalidad de las larvas. Los resultados del análisis estadístico Probit-log de los bioensayos para determinar la actividad larvicida del AE, se muestran en la Tabla 3 y permitieron establecer la dosis diagnóstica de ppm (0.0348%) para el AE de E. globulus contra las larvas de A. aegypti Linn., junto con los valores de las concentraciones letales CL50= % y CL99= %. Los anteriores valores se aproximaron a los determinados para las mirtáceas cubanas Eugenia melanadenia y Psidium rotundatum, las cuales también presentaron efecto larvicida sobre A. aegypti. Los AE de estas especies vegetales también poseen el 1,8-Cineol o Eucaliptol, el Limoneno y el Pineno, entre sus componentes mayoritarios. Las dosis diagnósticas para los aceites esenciales de estas 2 plantas fueron de 0,022% (220 ppm) para E. melanadenia y de 0,0164 % (164 ppm) para P. rotundatum [1]. De igual manera, los valores se acercaron a los determinados para el AE de Curcuma aromatica con alta actividad contra larvas de cuarto estadio de A. aegypti con valores de CL50 de ppm [6] y para la canela indígena Cinnamomum osmophloeum Kaneh y otros aceites esenciales con excelente efecto inhibitorio contra larvas de cuarto estadio de variedades del mosquito Aedes, cuyos valores de CL 50 estuvieron entre ppm, y la CL 90 fue de ppm respectivamente [17, 18]. El presente estudio permite avanzar en la búsqueda de una alternativa natural para el control del vector causante de graves dolencias como la fiebre amarilla y del dengue en nuestra región tropical y ofrece una referencia para futuras investigaciones en cuanto a la susceptibilidad de las poblaciones del mosquito y otras plagas similares, frente a los AE de mirtáceas nativas.

9 GRÁFICA 1. Perfil cromatográfico del aceite esencial de Eucaliptus globulus recolectado en la vereda Iscalá del municipio de Chinácota (Norte de Santander).

10 Tabla 1. Componentes volátiles mayoritarios del Aceite Esencial (AE) de Eucalyptus globulus de la vereda Iscalá del municipio de Chinácota (Norte de Santander). Pico Concentración relativa (%) IK Exp. a IK Teórico b Compuesto c α Pineno β Mirceno Octaneno Limoneno 5 82, ,8 Cineol Dihidrocarveol Nerol 8 0, γ-terpineno 9 0, Acetato de Terpinen-4-ol 10 0, Eugenol 11 0, Isobutirato de Linalol 12 2, Bourboneno 13 0, Trimenal 14 0, Cedreno a Índice de Kováts experimental establecido por Cromatografía de Gases de Alta Resolución (CGAR) con Detector FID, en columna HP-5. b Adams, Robert (2005) Identification of essential oil components by gas chromatography/mass spectroscopy. Allured Publishing Corporation: Carol Stream Illinois, USA. 469p. c Identificado por Cromatografía de Gases con Detector Selectivo de Masas.

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12 Tabla 2. Concentración del AE de Eucaliptus globulus y % de mortalidad de los individuos. Concentración (ppm) Mortalidad (%)

13 TABLA 3. Análisis Probit-log de bioensayos de laboratorio de larvas de A. aegypti expuestas a diferentes concentraciones del aceite esencial foliar de E. globulus. CL Nivel de confianza Rango 2 = % < CL < = % < CL < = % < CL < = % < CL < = % < CL < = % < CL < Varianza de CL50 = Heterogeneidad = con 2 df. Dosis diagnóstica = ppm (0.0348%).

14 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. AGUILERA (L.), NAVARRO (A.), TACORONTE (J.), LEYVA (M.), MARQUETTI (M.) Efecto letal de mirtáceas cubanas sobre Aedes aegypti (Díptera: Culicidae). Rev. Cubana Med. Trop., 2055 (2): BANDONI, (A.) Los recursos vegetales aromática en Latinoamérica, su aprovechamiento industrial para la producción de aromas y sabores. Argentina: red de editoriales universitarias. pp , , BIOCOMERCIO SOSTENIBLE. (2003). Estudio del Mercado Colombiano de Aceites Esenciales. Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander Von Humboldt, Bogotá, Colombia. 4. BOUKEF (K.), BALANSARD (G.), LALLEMAND (P.), BERNARD (P.) Etude des hétérosides et aglycones flavoniques isolés des feuilles d Eucalyptus globulus L. Planta med. Phytother., 10, CHENG (S.), LIU (J.), CHANG (S.), TSAI (K.), CHEN, (W.) CHAN, (S.) Chemical Composition and Mosquito Larvicidal Activity of Essential Oils from Leaves of Different Cinnamomum osmophloeum Provenances. J. Agric. Food Chem., 52 (14), pp CHOOCHOTE (W.), CHAIYASIT (D), KANJANAPOTHI (D), RATTANACHANPICHAI (E), JITPAKDI (A), TUETUN (B), PITASAWAT (B) Chemical composition and anti-mosquito potential of rhizome extract and volatile oil derived from Curcuma aromatica against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Department of Parasitology, Faculty of Medicine, Chiang Mai University, Chiang Mai 50200, Thailand. J. Vector Ecol., (2): FREDMEYER, Healthnotes Eucalipto. [Citada en 13 de Enero de 2006]: Disponible en internet 8. GARCÍA (L.), ROJO (D.), GARCÍA (V.), HERNÁNDEZ (M.) Plantas con propiedades antiinflamatorias. Rev. Cubana Invest. Biomed., 21(3): GRAINGE (M.), AHMED (S.) Handbook of plants with pest-control properties. John Wiley & Sons. New York, USA. 470p. 10. KOZUKA (M.) The granulation and inhibiting principles from Eucalyptus globulus L. T. Chem. Pharm. Bull., 30, OMS Resistencia de los Vectores de Enfermedades a los Plaguicidas. 15º Informe del Comité de Expertos de la OMS en Biología de Vectores y Lucha Antivectorial (Serie de Informes Técnicos Nº 818). Ginebra. Suiza. 12. OSAWA (T.), NAMIKI (M.) A novel type of antioxidant isolated from leaf wax Eucalyptus leaves. Agric. Biol. Chem., 45, THERAPEUTIC RESEARCH FACULTY Compiled by Pharmacist s Letters Editors. Natival Medicines: Comprenhensive Database. 70ed. 14. TRIGG (J.), HILL (N.) Laboratory evaluation of a eucalyptus-based insect repellent against four biting arthropods. Phytother Res., 10: Reviewed by Yarnell E. Selected herbal research summaries QRNM; WHO Instrucciones para determinar la resistencia y/o susceptibilidad de las cucarachas a los insecticidas. WHO/VBC/ Ginebra.

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