CENTRÍFUGAS centrífugas

Transcripción

1 CENTRÍFUGAS La centrifugación es un procedimiento físico que permite la separación de partículas, bien sean células, orgánulos, moléculas, etc. en base a la diferente velocidad a la que sedimentan en un medio acuoso bajo la acción de un campo centrífugo. Este campo se aplica en unos aparatos denominados: centrífugas por medio de la rotación de una de las piezas, llamada rotor, a gran velocidad dentro de una cámara acorazada en la que puede estar la temperatura controlada (para evitar la degradación de muestras termosensibles) y en ocasiones bajo vacío (para evitar el calentamiento del rotor por el rozamiento con el aire). Como ya sabéis (Ver Fig.2.1), todo cuerpo sometido a un movimiento giratorio según una trayectoria circular de radio R con una velocidad angular w experimenta una fuerza (Fc.) que tiende a alejar al cuerpo del centro de giro.

2 Esta fuerza se conoce como Fuerza Centrífuga y su valor vendrá expresado por: donde: m = masa del cuerpo. El número de veces que la fuerza centrífuga supera a la fuerza de gravedad se denomina Factor Centrífugo, el cual nos permite evaluar la eficiencia de una centrífuga operada bajo estas condiciones al compararla con el proceso regulado solo por la gravedad. El Factor Centrífugo se expresa como: donde: C = RCF = Factor centrífugo. Fc = Fuerza centrífuga (Kg.). p = Peso del objeto o partícula (Kg.). m = masa del cuerpo (Kg.). g = aceleración de la gravedad (9.81 m/s 2 ). w = velocidad angular (radianes/s). R = Radio de giro (m). N = Revoluciones por minuto (rpm) Para un cálculo aproximado puede utilizarse la expresión: Debemos destacar que el Factor Centrífugo se denomina también como "G" o "Z", planteando que determinada centrífuga

3 genera un campo centrífugo de tantas "g". Las rpm, las g y el radio se pueden relacionar entre sí por medio de unos diagramas denominados: Nomogramas. Así, podemos trabajar indistintamente con unos valores u otros o realizar ciclos de centrifugaciones idénticos con rotores o centrífugas distintas entre sí. En la siguiente página se presenta uno de ellos. Trazando una línea recta entre 2 valores de los 3 que tenemos presentados podemos despejar el valor restante que no conocíamos.

4

5 En todos los tipos de rotores existentes es fundamental colocar siempre bien equilibradas las cargas (en forma simétrica) para evitar desgastes anormales de rodamientos y vibraciones excesivas en las subidas y bajadas de velocidad.

6 Existen 2 tipos de rotores: +De ángulo fijo: Los tubos se alojan con un ángulo fijo respecto al eje de giro. Se usan habitualmente para volúmenes grandes. El caso extremo es el de los rotores verticales en que los tubos se sitúan paralelos al eje de giro. Los rotores de ángulo fijo se emplean principalmente para sedimentar materiales hasta que formen una masa muy compacta en el fondo del tubo (pellet) y después por decantación, separar fácilmente el sobrenadante del sedimento. Resultan muy eficaces para este propósito debido a que el material se mueve únicamente un corto trecho hasta la pared del tubo de la centrífuga, aquí se acumula y resbala rápidamente hasta el fondo del tubo.

7 +Basculantes: Los tubos se hallan dentro de unos cestillos que cuelgan. Estos cestillos están unidos al rotor con un eje y cuando la centrífuga gira, se quedan suspendidos en dirección perpendicular a la del rotor. Se usan en la centrifugación zonal (o en bandas) a través de gradientes de densidad preformados (normalmente de sacarosa o glicerol) o bien para separar partículas con coeficientes de sedimentación muy similares. La sacarosa es el material más comúnmente usado debido a su pureza, bajo coste y su no interferencia con la mayoría de las mediciones químicas, ópticas o enzimáticas. Si la macromolécula en estudio es un enzima o una proteína inestable, se usa con frecuencia el glicerol puesto que muchas proteínas son más estables y se desnaturalizan más difícilmente en presencia de glicerol.

8

9 Hay diferentes tipos de centrífugas según el rango de velocidades de giro: A. Centrífugas de baja velocidad, de sobremesa o clínicas. De pequeño tamaño y normalmente sin refrigeración. Alcanzan una velocidad máxima de rpm. Útiles para la separación de partículas grandes como células o precipitados de sales insolubles. Las centrífugas microfuge o biofuge serían una variante de las anteriores que permiten llegar a velocidades de hasta rpm, siendo los volúmenes de trabajo muy pequeños (microtubos) y pudiendo ser refrigeradas o no. Son útiles en el campo de la biología molecular.

10 B. Centrífugas de alta velocidad. Alcanzan velocidades máximas entre y rpm (pueden generar alrededor de g). Son refrigeradas y normalmente tienen sistema de vacío para evitar el calentamiento del rotor a causa del rozamiento con el aire. Este mismo sistema de vacío permite que puedan tener un control más exacto de la temperatura que aquellas que no hacen vacío. Son útiles en la separación de fracciones celulares, pero insuficientes para la separación de ribosomas, virus o macromoléculas en general.

11 C. Ultracentrífugas. Superan las rpm, por lo que tienen sistemas auxiliares de refrigeración para refrigerar no sólo la cámara del rotor donde están las muestras sino también el motor y además sistemas auxiliares de vacío para alcanzar un altísimo nivel de vacío. Pueden generar más de g, las cuales son suficientes para separar proteínas pequeñas. Las ultracentrífugas se dividen en: analíticas y preparativas. La diferencia más importante entre ellas es que la analítica cuenta con un sistema óptico para visualizar la sedimentación de la muestra en tiempo real lo que permite la obtención de datos precisos de propiedades de sedimentación (coeficientes de sedimentación, pesos moleculares) siendo éste el objetivo primordial y no la purificación de la muestra para un uso posterior, que sí sería el objetivo de la preparativa, útil para aislar partículas de bajo coeficiente de sedimentación (microsomas, virus, macromoléculas), siendo este tipo el inmensamente mayoritario de ultracentrífuga.

12 En este esquema de una ultracentrífuga preparativa de sobremesa se puede apreciar como existe una barrera de protección primaria de acero (19 mm de grosor) rodeada a su vez por otra capa de acero (13 mm de grosor) que actúa como una barrera secundaria para dar plena protección al operador. En cualquier centrífuga la parte más débil siempre es la tapa superior.

13 RUTINAS DE MANTENIMIENTO Las rutinas de mantenimiento que requiere una centrífuga dependen de múltiples factores tales como de la tecnología incorporada, la intensidad de uso, la capacitación de los usuarios y las condiciones del ambiente donde se encuentra instalada. Para los rotores: + Registrar la fecha de compra de cada uno de los rotores así como los datos relativos a modelo y número de serie, cumpliendo las especificaciones que dé el fabricante. + No sobrepasar las indicaciones de velocidad máxima ni de densidad de muestras recomendadas por el fabricante. Cada rotor está diseñado para soportar un máximo nivel de esfuerzo que nunca se debe sobrepasar por seguridad. + Utilizar los rotores únicamente en las centrífugas para las que han sido fabricados. No intercambiar rotores sin antes verificar su completa compatibilidad. + Acatar las recomendaciones relativas a reducir la velocidad de operación cuando se trabaja con soluciones de alta densidad, tubos de acero inoxidable o adaptadores plásticos. + Utilizar rotores de titanio si se trabaja frecuentemente con soluciones salinas. + Para el caso de rotores de aluminio proteger la capa de aluminio anodizado de la que están recubiertos no utilizando detergentes alcalinos o soluciones que pudieran retirar dicha película protectora. + Utilizar cepillos plásticos en las actividades de limpieza de los rotores y detergentes suaves en baja concentración. Los cepillos

14 metálicos rayan el recubrimiento protector y esto genera fuentes de futura corrosión que acortan la vida útil del rotor. + Lavar el rotor inmediatamente en el caso que se hayan producido derrames de sustancias corrosivas, secándolo al aire y no en estufa. + Almacenar los rotores en ambientes secos y boca abajo, sin la tapa correspondiente. + Lubricar las roscas y anillos de goma (O-rings) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. + Nunca tratar de abrir una tapa de una centrífuga que esté funcionando ni intentar parar el rotor con la mano. + En el caso de rotores de ultracentrífuga siempre que se usen hay que consignar el rotor y tiempo empleado porque los de aluminio o titanio sufren fatiga de material y hay que cambiarles el disco de sobrevelocidad a medida que cumplen el número de horas de uso establecido y desecharlos si se les ha acabado el período de vida útil. Este tema ha sido resuelto con los últimos rotores de fibra de carbono que presentan entre sus ventajas que son más ligeros, más rápidos (aceleran hasta la velocidad deseada y deceleran después más rápidamente que los convencionales) y también son más duraderos y se pueden reparar. Para los tubos (o botellas): + Verificar si los tubos son reutilizables o son de un único uso. Siempre es preferible usarlos nuevos a que se nos puedan romper y perder las muestras, teniendo que limpiar después todo el rotor. + Lavar los tubos, adaptadores y demás accesorios a mano usando un detergente suave diluido en agua y un cepillo de textura suave que no sea metálico. Evitar usar los lavavajillas para este tipo de tubos ya que pueden producir rayaduras.

15 + Evitar el uso de alcohol y acetona puesto que dichos materiales afectan la estructura de los tubos. Los fabricantes recomiendan el tipo de solvente a emplear con cada tipo de material con que se fabrican los tubos de centrifugación. + Evitar secar los tubos en estufa. Es mejor que se sequen al aire. + Almacenar los tubos o botellas en un lugar oscuro, seco y fresco y alejados de fuentes de vapores químicos o de fuentes de luz ultravioleta. + Verificar no sobrepasar los niveles máximos de llenado para evitar su colapso o vertido dentro del rotor. MANTENIMIENTO PREVENTIVO Las rutinas de mantenimiento más importantes que se le efectúan a una centrífuga son: Periodicidad mensual: Revisar que el rotor no se haya visto afectado por derrames. Limpiar la cubeta de la centrífuga con etanol al 70% que actúa también como desinfectante. Lubricar el eje con una grasa tipo Spinkote. Verificar el estado de las juntas de estanqueidad (sustituir si es necesario o bien solamente lubricar los anillos de goma con silicona de vacío). Para rotores de cestillos, lubricar los puntos de apoyo de los cubiletes con grasa adecuada. Quitar polvo y posibles manchas de la superficie externa de la centrífuga. Verificar el estado del mecanismo de cierre de la tapa para garantizar la seguridad de los operadores. Comprobar que en teclados de membrana no exista señal de que los estén manipulando con las uñas en vez de con las

16 yemas de los dedos porque de lo contrario se acaba perforando la membrana de protección. Periodicidad anual: Verificar el estado de las escobillas del motor y sustituir si es necesario (normalmente solo para centrífugas bastante antiguas). Hoy en día casi todas llevan motores de inducción sin escobillas y rodamientos sin mantenimiento. Comprobar el estado de la toma de aire y limpiarlo o sustituir el filtro si dispone de él.

17 Para máquinas refrigeradas efectuar una limpieza del radiador para que haya un buen flujo de aire y no se pierda eficacia en el sistema de refrigeración. En el caso de centrífugas que lleven bombas de vacío de aceite, cambiar los aceites tanto a la bomba de vacío como a la bomba difusora. PARTE PRÁCTICA Como parte práctica se procederá a desmontar, limpiar, engrasar y volver a montar un rotor de diversos tipos de centrífuga. Asimismo se enseñarán los distintos tipos de centrífugas y rotores que poseemos en el primer piso del departamento para investigación.

18