Identificación genética de la línea celular. Método y resultado Genetic identity of the cell line. Method and result

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1 (TRONCALES) National Bank of Stem Cell Lines IMPRESO DE SOLICITUD DE DEPÓSITO DE UNA LÍNEA Application Form to Deposit a Human Cell Line Documentos que se acompañan: Attached documents: Copia de la autorización de derivación de la línea celular, junto con informe del Comité Ético del centro de procedencia. A copy of the authorization for the derivation of the cell line, with the corresponding ethics committee approval Copia de cualquier publicación científica relacionada con la derivación y/o caracterización de la línea. A copy of any relevant published scientific papers related to the derivation and/or characterization of the cell line C. V. del investigador principal (una página; formato libre). A one page CV for the Principal Investigator Otros (especificar). Others (specify) ANEXO SECCIÓN 1 Section 1 Información General General Information Nombre de la línea: Name of the line: Investigador principal: Principal Investigator: VAL-9 Carlos Simón Vallés Origen de la línea celular: Origin of the cell line Embrionario Fetal Adulto Embryonic Fetal Adult La línea celular ha sido derivada de un embrión con anomalía genética? Has the cell line been derived from an embryo with genetic anomaly? NO SÍ (especificar) No Yes (specify) Identificación genética de la línea celular. Método y resultado Genetic identity of the cell line. Method and result Fingerprinting Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 1 de 23

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3 SECCIÓN 2 Section 2 Datos del Depositante Applicant Details Investigador Principal: Principal Investigator: Carlos Simón Vallés Centro de Trabajo: Institution: Centro de Investigación Príncipe Felipe (C.I.P.F.) Dirección Postal: Postal address: Av. Autopista del Saler, 16 Teléfono (phone): Fax: csimon@cipf.es SECCIÓN 3 Section 3 Datos de la Línea Celular Details of Cell Line Tipo de muestra biológica (especificar estadio embrionario, semanas de gestación, ) Kind of biological sample (specify embryonic stage, weeks of pregnancy,...) Embrión humano en estadío de mórula compacta y detenida en día 6 de desarrollo. Human embryo, morulae stage arrested on day 6 of development. Muestra biológica Biological simple Fresco Fresh Crioconservado Cryopreserved Fecha de la obtención de la muestra biológica Date of obtaining the biological sample Congelación: 21/05/2001 Recepción: 15/02/2008 Fecha del uso o descongelación (si congelado) Date used or thawed (if frozen) 20/10/2008 Freeze: 21/05/2001 Reception: 15/02/2008 Fecha de la donación del muestra biológica Date of donation of the biological sample 19/01/2006 Descripción general del procesamiento previo del muestra biológica utilizado (cultivo embrionario, procesamiento muestra fetal o de tejido adulto) General description of the processing of the biological sample used (embryonic culture, processing of fetal sample or of adult tissue) El embrión vitrificado en estadío de mórula compacta en día 6 de desarrollo y donado fue desvistrificado mediante un protocolo con DMSO y etilenglicol. Posteriormente fue mantenido en medio CCM (Vitrolife) desde día 6 hasta día 7 de desarrollo, en el que no se observa ninguna evolución de la mórula. Se retiró su zona pelúcida con ácido tyrodes, y se puso en co-cultivo con células de Foreskin irradiadas y medio de cultivo hes y bfgf. The vitrified and donated embryo was thawed following a devitrification protocol with DMSO and ethilenglicol, and was maintained in CCM medium (Vitrolife), since day 6 of development until day 7 when any change was observed in the compacted morulae. The zona pellucida (ZP )was removed with tyrodes acid and the embryo was co-cultured with irradiated Foreskin cells and hes medium plus bfgf. Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 3 de 23

4 En caso de muestra embrionaria, indicar si se utilizaron blastómeros o células de la masa celular interna y el método de aislamiento utilizado If of embryonic origin, indicate whether blastomeres or internal cell mass were used, as well as the isolation method Se utilizó una mórula compacta y detenida a la cual se le retiró la zona pelúcida con ácido tyrodes. An arrested compacted morula was used. The zona pellucida was removed with tyrodes acid. Origen del soporte celular o acelular utilizado para la derivación, así como de los componentes de los medios de cultivo (si se describen en publicación, indicar además referencia) Origin of the cellular or cellular free support used in derivation in addition to the components of the culture mediums (if they are described in a publication, please indicate the reference). Soporte cellular /cellular support : human foreskin fibroblasts CCD1112Sk (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA. Nº catálogo: CRL-2429). Componentes del medio para Feeder / Feeder medium components: 90% Iscoves Modified Dulbecco s médium (ATCC), nº Catálogo: ) + 10%Fetal Bovine Serum ((Gibco), nº catálogo: ). Componentes del medio para hesc/ hesc medium components: 80% Knockout DMEM (Gibco/BRL, Paisley, Scotland, UK; nº catálogo ), 20% Knockout SERUM Replacement (Gibco/BRL; nº catálogo: ), 1 mm L-glutamine solution (Gibco/BRL; nº catálogo: ), 1% MEM non essential amino acids (100x) (Gibco/BRL; nº catálogo: ), 0.1 mm β-mercaptoethanol (Gibco/BRL; nº catálogo: ), 10 ng/ml human recombinant basic fibroblast growth factor (bfgf) (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA ; nº catálogo: ). Valbuena D, Galán A, Sánchez E, Poo ME, Gómez E, Sánchez-Luengo S, Melguizo D, García A, Ruiz A, Moreno R, Pellicer A, Simón C. Derivation and characterization of three new Spanish human embryonic stem cell lines (VAL-3,-4,-5) on human feeder and in serum-free conditions. Reproductive BioMedicine Online 2006; 13(6): Poo ME, Aguilar C, Gómez E, Sánchez E, Marqués-Marí A, Galán A, Medrano J, Riboldi M, Ruiz V, Enseñat-Waser R, Valbuena D, Simón C. Derivation, Characterization, Differentiation and Registration of Eight Human Embryonic Stem Cell Lines (VAL-3, -4, -5, -6M, -7, -8, and -9) on Human Feeders. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal; Submited. Mantenimiento de la línea: Line maintenance Ratio de pase: Passage ratio 1:3-1:4 Método de pase: Passage method mecánico / mechanical Xenobióticos si no Xenobiotics Yes No Descripción de las características morfológicas de la línea en cultivo (forma y tamaño colonias; forma y tamaño células; ratio núcleo/citoplasma; otros) Description of the morphological characteristics of the line in culture (form and size of the colonies; form and size of the cells; nucleus/cytoplasm ratio; others) Morfología característica de células madre: colonias aplanadas, translúcidas y con bordes definidos, con células homogéneamente dispuestas en monocapa, y ratio núcleo/citoplasma elevado. Se agrupan en colonias de células. Characteristic morphology of human embryonic stem cells: flat colonies, translucent, with defined borders, with cells homogeneusly located in a monolayer, and a high ratio of nucleus/cytoplasm. Colonies with cells. Controles microbiológicos realizados (indicar detalladamente) Microbiological controls carried out (indicate in detail) El soporte celular fue testado para: bacterias habituales, Mycoplasma, endotoxinas, citomegalovirus, Epstein-Barr, VHB, VHC, herpes humano 6(A) y 6(B), VIH1, VIH2, HTLV-I/II, parvovirus y transcriptasa reversa. Los resultados fueron negativos. Los controles fueron realizados por el Instituto Valenciano de Microbiología (IVAMI), entidad homologada por AENOR, ENAC y Consellería de Sanitat. La línea fue testada para Mycoplasma y patógenos habituales. De forma rutinaria se realizan controles microbiológicos que aseguran la ausencia de microorganismos en las condiciones de cultivo utilizadas. Cellular support was tested for: usual bacteria, Mycoplasm, endotoxin, cytomegalovirus, Epstein-Barr, HBV, HCV, human herpes 6(A) y 6(B), HIV1, HIV2, HTLV-I/II, parvovirus and reverse transcriptase. Results were negative. Controls were done by the Instituto Valenciano de Microbiología (IVAMI), homologated by AENOR, ENAC and Consellería de Sanitat. Cell line was tested for Mycoplasm and common pathogens. Routinely, we perform microbiologic controls that ensure the absence of microorganisms in the culture conditions used. Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 4 de 23

5 Marcadores: Markers Método nº pase resultado comentarios (ARN/proteínas) Method Passage n. results comments (RNA/proteins) Oct 4 PCR e inmunocitoquímica (ICQ) / PCR and immunocytochemistry ( ICC) 9 + indiferenciación / indiferentiation Nanog PCR e ICQ/ PCR and ICC 9 + indiferenciación / indiferentiation Rex 1 Sox 2 SSEA3 SSEA4 ICQ / ICC 9 + indiferenciación / indiferentiation TRA-1-60 ICQ / ICC 9 + indiferenciación / indiferentiation TRA-1-81 ICQ / ICC 9 + indiferenciación / indiferentiation Telomerasa/Telomerase PCR 5 + indiferenciación / indiferentiation Fosfatasa Alk. /Alkaline phosphatase ICQ / ICC 9 + indiferenciación / indiferentiation Cariotipo / Karyotype bandas G / G bands 6, 10 46,XY masculino normal / normal male Otros / Others Cripto, Dnmt3b, Gabr, Gdf3 PCR 5 + indiferenciación / indiferentiation Nfh PCR 5 - diferenciación / diferentiation (ectodermo) / (ectoderm) Ren PCR 5 - diferenciación / diferentiation (mesodermo) / (mesoderm) Amy PCR 5 - diferenciación / diferentiation (endodermo) / (endoderm) Capacidad de diferenciación Differentiation capacity Ectodermo/ Ectoderm Endodermo/Endoderm Mesodermo/ Mesoderm marcador pase resultado marcador pase resultado marcador pase resultado marker passage result marker passage result marker passage result In Vitro tubulin β-iii 7 positivo α-fetoproteina 7 positivo actina muscular 7 positivo In vitro tubulin β-iii 7 positive α-fetoprotein 7 positive muscle actin 7 positive In vivo / in vivo Método: inducción de teratomas Resultado: positivo Method: teratomas induction Result: positive Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 5 de 23

6 Descripción de las características de diferenciación in vitro Description of the differentiation characteristics in vitro Formación de cuerpos embrioides e inmunocitoquímica para marcadores de diferenciación de ectodermo, mesodermo y endodermo. Embryoid bodies formation and immunostaining against differentiation markers from ectoderm, mesoderm and endoderm. Datos de la determinación de pluripotencialidad in vivo o formación de teratomas Data of the pluripotentiality determination in vivo or teratoma formation Inyección intratesticular en ratones SCID de 30 colonias de la línea por testículo ( células). Transcurridas 12 semanas, se sacrificaron los ratones y se obtuvieron tumores cuyo análisis anatomo-patológico e inmunohistoquímico demostró que se trataba de teratomas formados por tipos celulares propios de ectodermo, mesodermo y endodermo. Intratesticular injection in SCID mice of 30 cell colonies of the line/testis (90, ,000 cells). After 12 weeks, the mice were sacrificed and tumors were obtained. Anatomopathological analysis and immunohistochemistry of tumors showed that they were teratomas with typical tissues from the ectoderm, mesoderm and endoderm. Datos de la tipificación HLA HLA typification data HLA-A*0201, HLA-A*1101 HLA-B*0702, HLA-B*5101 HLA-Cw*0202, HLA-Cw*0702 HLA-DRB1*1101, HLA-DRB1*1501 HLA-DRB3*0202 HLA-DRB5* HLA-DQA1*0505, HLA-DQA1*0102 HLA-DPB1*0301,HLA-DPB1*0602 HLA-DPB1*0401,HLA-DPB1*0501 Consistencia celular tras 6 pases de congelación y descongelación. Resultados. Cell consistency alter 6 passages of freezing and thawing. Results. La línea celular se mantiene estable tras más de 6 pases siguiendo los procedimientos de congelación y descongelación propios. The cell line is stable for more than 6 passages following our freezing and thawing protocol. Valbuena D., Sánchez-Luengo S., Galán A., Sánchez E., Gómez E., Poo ME, Ruiz V, Genbacev O., Krtolica A., Pellicer A., Moreno R., Simón C. An Efficient Slow Freezing hesc Cryopreservation Method in Xeno-Free Conditions without the use of a programmable freezer. Reproductive BioMedicine Online, 2008 ; 17(1) : Pase en el momento del registro Passage at the time of the recording Pase 33 Passage 33 Ha sido la línea modificada genéticamente? Has the line been genetically modified? Se llevó a cabo un análisis clonal? Has a clonal analysis been carried out? Sí Yes Comentarios/ Comments: No No Sí/ Yes No Resultado / Result Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 6 de 23

7 Otras observaciones o información relevantes (a juicio del Investigador Principal): Other observations or relevant information (to the discretion of the Principal Investigator): La línea celular VAL-9 procede de un embrión supuestamente detenido en día 6 desarrollo, en estadío de mórula. VAL-9 cell line was derived from an embryo morulae stage allegedly arrested on day 6 of development. Otras observaciones o información relevantes (a rellenar por el BNLC): Other comments or relevant information (to be completed by BNLC) Seguimiento de la línea (a rellenar por el BNLC): Follow up of the line (to be completed by BNLC) Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 7 de 23

8 SECCIÓN 4 Declaración Confirmo que la información contenida en estos impresos es cierta y asumo total responsabilidad sobre la misma. I confirm that the information contained in this form is true and I assume total responsibility for it. Firma en Representación del Centro / Signature in Representation of the Centre (Representante legal del Departamento/Centro) (Legal Reprentative of the Department/Centre) Rubén Moreno Palanques Firma del Investigador Principal Signature of the Principal Investigator Carlos Simón Vallés Fecha/ Date: 31/03/2009 Fecha /Date 31/03/2009 Nombre y Cargo de la Persona Representante del Centro: Name and Position of the Person Representing the Centre: Rubén Moreno Palanques. Director General. Dirección Postal: Postal Address: Centro de Investigación Príncipe Felipe Av. Autopista del Saler, Valencia Teléfono /Telephone: Fax: rmorenop@cipf.es Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 8 de 23

9 ANEXO Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 9 de 23

10 MORFOLOGÍA DE VAL-9 (A) Mórula tardía (40x), (B) morfología típica colonias de VAL-9 (4x). A B Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 10 de 23

11 TIPIFICACIÓN HLA DE VAL-9 Llevado a cabo en el pase 6, por el Centro de Transfusiones de la Comunidad Valenciana. Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 11 de 23

12 MARCADORES INDIFERENCIACIÓN DE VAL-9 Expresión de antígenos de indiferenciación en VAL-9 Inmunocitoquímica para OCT-4 (A), Nanog (B) (R&D, Minneapolis, MN), SSEA-1 (C), SSEA-4 (D), Tra-1-60 (E) y Tra-1-81 (F) (Chemicon, Temecula, CA). Barra de escala = 100 µm. A B C D E F Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 12 de 23

13 D E F Ensayos de actividad de fosfatasa alcalina en VAL-9 Inmunocitoquímica para isoenzima Fosfatasa Alcalina clon TRA 2-54/2J (Chemicon,Temecula,CA) (A) ; DAPI (B); Fosfatasa Alcalina + DAPI (C). Barra de escala = 100 µm. A B C Expresión de marcadores moleculares de indiferenciación de VAL-9 RT-PCR positiva en pase 5 para Oct-3/4 (1), Nanog (2) Cripto (3), Dnmt3 (4), Gabr (5), y Gdf (6) y negativa para Nfh (7), Ren (8) y Amy (9). El control interno de expresión utilizado es RPL19 (10) Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 13 de 23

14 Determinación de la existencia de actividad telomerasa en VAL-9 La detección de la actividad telomerasa característica de células inmortales se ha realizado mediante una reacción de PCR utilizando un kit específico (TRAPEZE Telomerase Detection Kit; Chemicon, Australia) y tinción con SYBR (Molecular probes, USA). El análisis de la actividad telomerasa se realizó sobre células intactas de VAL- 9 en pase 5 (1), utilizando otra línea de células madre embrionarias humanas como control positivo (2). Como controles negativos, se utilizaron células de VAL-9 inactivadas por calor (3), y fibroblastos (4) Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 14 de 23

15 ESTUDIO DEL CARIOTIPO DE VAL-9 Llevado a cabo en el pase 6, por un laboratorio independiente (IVI Murcia, España). Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 15 de 23

16 PLURIPOTENCIALIDAD DE VAL-9 Diferenciación espontánea in vitro de VAL-9 Por flotación, en placas de no adhesión, se generan cuerpos embriodes y se mantienen en esas condiciones entre 4 y 7 días. Barra de escala = 1000 µm. Transcurrido ese tiempo, los cuerpos embrioides se transfieren a placas cubiertas con gelatina 1% para facilitar su adhesión. Durante el cultivo en placa, se obtuvieron diferentes tipos celulares (A) y en día 9 de cultivo se observaron focos de latido (B): A B Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 16 de 23

17 Tras días, se fijan y se analizan marcadores de diferenciación característicos de (A) ectodermo (tubulin, β-iii), (B) mesodermo (actina muscular) y (C) endodermo (α-fetoproteína). Barra de escala = 50 µm para (A) y (C) y 20 µm para (B). Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 17 de 23

18 Diferenciación espontánea in vivo de VAL-9 Para desarrollar los experimentos de diferenciación in vivo de las líneas, se utilizan ratones macho de 8 semanas de edad, con inmunodeficiencia severa combinada (SCID). Las colonias de células madre utilizadas se aíslan mecánicamente de la monocapa de feeder. Se inyectan 30 colonias por testículo. La aparición de tumores se puede detectar por palpación transcurridas 8 semanas de la inyección. El desarrollo de los mismos se mantiene durante 2-4 semanas más, momento en el que los animales se sacrifican por desnucación cervical. Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 18 de 23

19 Las muestras son fijadas y enviadas para estudio anatomopatológico por parte de un laboratorio independiente (CITOPAT, S.L.). Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 19 de 23

20 Microscópicamente, la búsqueda se orienta hacia la identificación de tejidos fácilmente distinguibles como (A) entramado fibrilar, (B) nidos de condrocitos o (C) glándulas. Barra de escala = 100 µm. A B C Para confirmar la presencia de derivados de las tres hojas embrionarias, se analizan marcadores de diferenciación característicos de (A) ectodermo (tubulin, β-iii), (B) mesodermo (actina muscular) y (C) endodermo (α-fetoproteína). Barra de escala = 100 µm. A B C Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 20 de 23

21 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE VAL-9 Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 21 de 23

22 Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 22 de 23

23 SOPORTE CELULAR Ficha técnica y análisis microbiológicos del Feeder utilizado en la derivación y mantenimiento de las líneas: Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3 Página 23 de 23