Diagnóstico Molecular de Plagas en la UCDSV mediante la PCR. Laboratorio de Biología Molecular

Transcripción

1 Diagnóstico Molecular de Plagas en la UCDSV mediante la PCR Laboratorio de Biología Molecular Dra. Ida Bartolini Blgo. Arturo Olórtegui

2 El laboratorio de Biología Molecular constituye un apoyo muy importante para los distintos laboratorios de la UCDSV y continuamente implementa, capacita y transfiere los métodos de diagnóstico molecular del tipo PCR a los laboratorios para su ejecución. Viroide de la Mancha Solar del Palto Sunblotch (ASBVd) Viroide del Tubérculo ahusado de la papa (PSTVd) Viroide de Exocortis de los Cítricos (CEVd) Viroide de la Cachexia de los Cítricos, (CCaVd) Virus del Tristeza de los Cítricos (CTV) Virus de la Leprosis de los Citricos (CiLV) Virus del Mosaico de la Bractea del Banano (BBrMV) Virus del Cogollo Racimoso del Banano (BBTV) Virus del Mosaico del Pepino (CMV) Virus del Pallidosis de la Fresa (SPaV) Virus del Falso Amarilleo del melón (BPYV) Fitoplasmas en diversos cultivos Xylella fastidiosa (Clorosis Variegada de los Cítricos, CVC) Candidatus liberobacter (Huan Long Bing de los Cítricos, HLB)

3 PORQUE SON IMPORTANTES LOS METODOS MOLECULARES BASADOS EN LA PCR? son muy específicos porque están basados en la secuencia genética del agente infeccioso son muy sensibles porque replican millones de veces la secuencia del patógeno de interés son muy versátiles porque se aplican a todas las áreas biológicas son muy rápidos

4 EN QUE CONSISTE LA PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)? Extracción de ácidos nucleicos Muestra ADN/ARN FASES de la PCR : 1.- DENATURACION 2.- ANILLAMIENTO 3.- EXTENSION Termociclador Separación de las hebras (94 C) Unión de los primers al ADN (52-62 C) Duplicación del número de copias (72 C) El Proceso de la PCR se puede comparar al trabajo de una fotocopiadora que obtiene millones de copias por hora

5 METODOLOGIA DE LAS TECNICAS MOLECULARES DE PCR Selección y Extracción de ácidos nucleicos (ADN/ARN) Pre - PCR PCR Toma y envío de muestras Post- PCR: Análisis de resultados PCR convencional PCR tiempo real Usuario 100bp LiP1 LiP2 NaH3 GeVds GeP Man Control + Control - H 2 O ASBVd SANO

6 Envío de muestras: Tomar las muestras, envolverlas en papel toalla y colocarlas dentro de bolsas debidamente rotuladas Tratar de enviar las muestras el mismo día de la toma. En caso contrario refrigerarlas pero nunca congelarlas. Enviar las muestras en una caja que las proteja de los golpes, se puede colocar un gel refrigerante envuelto en papel toalla, teniendo cuidado de no humedecerlas. Que el tiempo de envío sea de 1 a 2 días Causales de rechazo: No cumplir con la calidad y cantidad indicada en el Instructivo de Trabajo Tejidos necróticos. Tejidos en mal estado de conservación. Tejidos con demasiado tiempo de haber sido colectados.

7 Calidad de material vegetal correcto para diagnostico molecular Material vegetal degradado que será rechazado Material fresco y turgente Con síntomas (en lo posible) No se recibirá material marchito, en descomposición, o desecado

8 Servicios de Diagnóstico Molecular ofrecidos por el SENASA: LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA: Candidatus liberobacter en Cítricos (HLB) con PCR 1 tiempo real Candidatus liberobacter (HLB) en Diaphorina citri con 2 PCR tiempo real Xyllela fastidiosa en Cítricos (CVC) con PCR tiempo 3 real Xyllela fastidiosa en Vid (enfermedad de Pierce) con PCR 4 tiempo real 5 Spiroplasma citri con PCR tiempo real 6 Burkholderia glumae con PCR tiempo real 7 Burkholderia gladioli con PCR tiempo real 8 Fitoplasmas en general con PCR tiempo real 9 Fitoplasma "Flavescence Dore" con PCR tiempo real 10 Fitoplasma "Bois Noir" con PCR tiempo real LABORATORIO DE MICOLOGÍA: Fusarium oxysporum f. sp cubense raza 4 Tropical con 11 PCR convencional 12 Guignardia citricarpa con PCR convencional 13 Phaeoacremonium sp. con PCR convencional 14 Phaeoacremonium aleophilum con PCR en tiempo real 15 Phaeoacremonium viticola con PCR en tiempo real 16 Phaeoacremonium parasiticum con PCR en tiempo real 17 Phaeoacremonium mortoniae con PCR en tiempo real 18 Phakopsora pachyrhizi con PCR en tiempo real 19 Phakopsora meibomiae con PCR en tiempo real LABORATORIO DE VIROLOGÍA: Viroide del Sunblotch Mancha Solar del Palto 20 (ASBVd) con RT-PCR tiempo real Viroide del Tubérculo Ahusado de la Papa(PSTVd) con 21 RT-PCR convencional Viroide del Exocortis de los Cítricos (CEVd) con 22 RT-PCR convencional Viroide de la Cachexia de los Cítricos (CCaVd) con 23 RT-PCR convencional Virus del Mosaico de la Bráctea del Banano (BBrMV) 24 con RT-PCR tiempo real Virus del Cogollo Racimoso del Banano (BBTV) con 25 PCR tiempo real Virus de la Tristeza de los Cítricos (CTV) con RT-PCR 26 convencional Virus de la Pallidosis de la Fresa (SPaV) con RT-PCR 27 convencional Virus del Falso Amarilleo de la Remolacha (BPYV) con 28 RT-PCR convencional Virus del Mosaico del Pepino (CMV) con RT-PCR 29 convencional Virus de la Leprosis de los Citricos (CiLV) con RT-PCR 30 tiempo real Virus de Psorosis de los citricos (CPsV) con RT-PCR tiempo real 31 LABORATORIO DE ENTOMOLOGÍA: 32 Planococcus ficus con PCR convencional

9 Guía 2014: UNIDAD DEL CENTRO DE DIAGNÓSTICO DE SANIDAD VEGETAL GUÍA DE SERVICIOS DE DIAGNÓSTICO DE PLAGAS Guía 2012: N Denominación del servicio 1. LABORATORIO DE ENTOMOLOGÍA: 1.01Identificación morfológica de insectos en semillas 1.02Identificación morfológica de insectos en vegetales con uso de preparaciones no microscópicas 1.03Identificación morfológica de insectos en vegetales con uso de preparaciones microscópicas 1.04Curso de identificación taxonómica de insectos 1.05Diagnóstico molecular de Planococcus ficus con PCR convencional 2. LABORATORIO DE MICOLOGÍA: 2.01Diagnóstico micológico en semillas con uso de medios de cultivo 2.02Diagnóstico micológico en plantas con uso de medios de cultivos específicos 2.03Diagnóstico micológico en órganos aéreos o subterráneos con uso de medios de cultivo específicos 2.04Diagnóstico micológico en turba y suelo con uso de medios de cultivo 2.05Curso de capacitación en diagnóstico de hongos fitopatógenas en material vegetal 2.06Diagnòstico molecular de Fusarium oxysporumf. sp cubenseraza 4 Tropical con PCR convencional 2.07Diagnóstico molecular de Guignardiacitricarpacon PCR convencional 2.08Diagnóstico molecular de Phaeoacremoniumsp. con PCR convencional 2.09Diagnóstico molecular de Phaeoacremoniumaleophilum con PCR en tiempo real con Sonda 2.10Diagnóstico molecular de Phaeoacremoniumviticola con PCR en tiempo real con Sonda 2.11Diagnóstico molecular de Phaeoacremoniumparasiticumcon PCR en tiempo real con Sonda 2.12Diagnóstico molecular de Phaeoacremoniummortoniae con PCR en tiempo real con Sonda 2.13Diagnóstico molecular de Phakopsorapachyrhizi con PCR en tiempo real con Sonda 2.14Diagnóstico molecular de Phakopsorameibomiae con PCR en tiempo real con Sonda 3. LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA: 3.01Diagnóstico bacteriológico de material vegetal empleando DAS-Elisa doble sandwichde anticuerpo 3.02Diagnóstico bacteriológico de material vegetal empleando medios de cultivos específicos. 3.03Diagnóstico bacteriológico en turba y suelo empleando medios de cultivos 3.04Curso de capacitación en diagnóstico de bacterias fitopatógenas en material vegetal 3.05Diagnóstico molecular de Candidatus liberobacteren Cítricos (HLB) con PCR tiempo real con Sonda 3.06Diagnóstico molecular de Candidatus liberobacter(hlb) en Diaphorina citri con PCR tiempo real con Sonda 3.07Diagnóstico molecular de Xyllela fastidiosa en Cítricos (CVC) con PCR tiempo real con Sonda 3.08Diagnóstico molecular de Xyllela fastidiosa en Vid (enfermedad de Pierce) con PCR tiempo con Sonda 3.09Diagnóstico molecular de Spiroplasmacitri con PCR tiempo real con SybrGreen 3.10Diagnóstico molecular de Burkholderia glumae con PCR tiempo real con SybrGreen 3.11Diagnóstico molecular de Burkholderia gladioli con PCR tiempo real con SybrGreen 3.12Diagnóstico molecular de Fitoplasmas en general con PCR tiempo real con Sonda 3.13Diagnóstico molecular del Fitoplasma "Flavescence Dore" con PCR tiempo real con Sonda 3.14Diagnóstico molecular del Fitoplasma"Bois Noir" con PCR tiempo real con Sonda 4. LABORATORIO DE VIROLOGÍA: 4.01Diagnóstico de virus en semillas con uso de Elisa indirecto 4.02Diagnóstico de virus en semillas con uso de DAS-Elisa 4.03Diagnóstico de virus en semillas con uso de Immunostrips 4.04Diagnóstico de virus en plantas con uso de Elisa indirecto 4.05Diagnóstico de virus en plantas con uso de DAS-Elisa 4.06Diagnóstico de virus en plantas con uso de Immunostrips 4.07Curso de capacitación en diagnóstico de virus fitopatógenos 4.08Diagnóstico molecular del Viroide del Sunblotch Mancha Solar del Palto (ASBVd) con RT-PCR tiempo real con Sonda 4.09Diagnóstico molecular del Viroide del Tubérculo Ahusado de la Papa(PSTVd) con RT-PCR convencional 4.10Diagnóstico molecular del Viroide del Exocortis de los Cítricos (CEVd) con RT-PCR convencional 4.11Diagnóstico molecular del Viroide de la Cachexiade los Cítricos (CCaVd) con RT-PCR convencional 4.12Diagnóstico molecular del Virus del Mosaico de la Bráctea del Banano (BBrMV) con RT-PCR tiempo real con Sonda 4.13Diagnóstico molecular del Virus del Cogollo Racimoso del Banano (BBTV) con PCR tiempo real con Sonda 4.14Diagnóstico molecular del Virus de la Tristeza de los Cítricos (CTV) con RT-PCR convencional 4.15Diagnóstico molecular del Virus de la Pallidosis de la Fresa (SPaV) con RT-PCR convencional 4.16Diagnóstico molecular del Virus del Falso Amarilleo de la Remolacha (BPYV) con RT-PCR convencional 4.17Diagnóstico molecular del Virus del Mosaico del Pepino (CMV) con RT-PCR convencional 4.18Diagnóstico molecular del Virus de la Leprosisde los Citricos(CiLV) con RT-PCR tiempo real con SybrGreen 4.19Diagnóstico molecular del Virus de Psorosisde los citricos(cpsv) con RT-PCR tiempo real con SybrGreen 5. LABORATORIO DE NEMATOLOGÍA: 5.01Extracción e identificación de nemátodos del suelo y tejido vegetal por el método de Baerman modificado 5.02Extracción e identificación de nemátodos formadores de quiste por el método de Fenwick modificado 5.03Curso de capacitación en identificación taxonómica de nemátodos fitoparásitos 6. LABORATORIO DE MALEZAS: 6.01Identificación de malezas al estado de semillas 6.02Identificación de malezas al estado de planta 6.03Curso de capacitación en identificación taxonómica de semillas de malezas 7. LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR: 7.01Curso de capacitación en Diagnóstico Molecular mediante PCR convencional y en Tiempo Real

10 Muchas Gracias!!!