Transcriptomics and Proteomics

Transcripción

1 Transcriptomics and Proteomics

2 Tipificación de la expresión: permite el estudio de la funcion de los genes Tipificación del RNA depende de la hibridizacion de los ácidos nucleicos Northern blot Producir el cdna Amplificar por PCR con primers especifico Utilizar un probe especifico Se utilizan para analizar un solo gen Northern: Electroforesis RNA se transfiere a una membrana Se hibridaza con un probe marcado Reverse northern blot: Se produce un cdna especifico

3 Nuclease protection: Un antisense RNA marcado se hibridaza en solución Se trata con RNasa A Se puede separar en una gel Permite cuantificar RT-PCR: mrna es trascrito al revés para producir cdna Se amplifica por PCR con primer especificos Se puede detectar cuantitativamente por real-time PCR Transcriptoma: la colección de todo el mrna celular Transcriptomics: el estudio del transcriptoma 3% del genoma codifica Transcriptoma debería ser mas simple (pero no es asi)

4 La complejidad del transcriptoma aumenta: Procesamiento Splicing alterno RNA editing Dscam (un gen que produce 40,000 transcripts) No todo los genes se expresan en todos los tejidos, etapas del desarrollo o son activados por estímulos Housekeeping genes: genes de mantenimiento Encendidos todo el tiempo al mismo nivel Célula human expresa alrededor de 15,000-20,000 mrna Algunos son abundantes, moderados o muy raros

5 Estudio de expresión global Muestreo directo de poblaciones de RNA o de bibliotecas de cdna Análisis por hibridizacion: DNA arrays El estudio del RNA es en realidad el estudio de: Steady-state of mrna level Rate of turnover No es el estudio del nivel de trascripción EST: expressed sequence tags De una biblioteca de cdna generada de mrna total se secuencia pequeñas regiones del cdna ESTs de Transcripts abundantes son mas comunes Estudio estadístico de estas cantidades puede permitir cuantificación relativa de la expresión Costoso producir cdna y la secuenciación

6 EST necesitan mucha secuenciación SAGE (serial analysis of gene expression): produce EST bien cortos (9-14bp) Los ESTs se unen en concatameros Múltiples cdna 50 veces mas efectivo que EST normales Son luego secuenciados para determinar su composición

7 DNA microarrays: permiten analizar miles de genes al mismo tiempo Método preferido para high-throughput expression analysis Puntos de DNA puestos en un matriz sólida Probes son hechas de una población de RNA especifica Composición de los probes depende de la abundancia de canda mrna La señal de hibridizacion permite cuantificación relativa Dos tipos de microarrays: SpotedDNA Printed oligonucleotide chips

8 Spotted DNA Se transfieren clones DNA individuales a una matriz de nylon No permiten alta densidad Se necesita un probe radiactivo en gran volumen Se necesita hacer una radiografía o phophorimager Estudios de expresión comparativa es trabajoso Primero un probe, después remueves el probe, ultimo reprobe Mejor utilizar probes fluorescentes Necesitan matrices de vidrio (glass)

9 Spotted DNA array Un robot imprime un cdna o DNA Ocurre hibridizacion con diferentes probes de RNA marcados Se rastrean un un scanner en canales diferentes para detectar fluorescencia Se pueden combinar las imágenes para determinar el patrón de expresión

10 Usualmente se pegan al array cdna Puede ser DNA si proviene de bacterias o levaduras (intrones bien pequeños y muy pocos) No se necesitan cdna completos Se usan ESTs La data viene de largesequencing projects El costo del robot es mayor de $100,000

11 Impresión de contacto: usa un tubo capilar Extrae la muestro Deposita la muestra en la matriz El pin se lava y seca antes de continuar Se pueden utilizar cabezas múltiples para acelerar el proceso

12 Pin and ring system: El ring se inserta en el liquido y recoge una cantidad Después el pin baja tomando una cantidad menor y depositándola en la matriz Se pueden utilizar impresoras inkjet: piezoelectric devices

13 Chips de oligonucleotidos Son de alta densidad Oligonucleotidos cortos (25-70nt) de hebra sencilla Los probes son sintetizados de RNA derivado de cdna (crna) trascrito in vitro Chip de oligo Se obtiene las secuencias de las bases de datos Se sintetizan en el mismo chip Cada gen es representado por 20 oligonucleotidos que no se solapan Cada uno tiene un match perfecto y un mismatch Se utiliza un probe de crna

14 Photolithography: the use of light-directed printing technology Los oligos se pueden producir de data genómica, cdna o ESTs Los oligo se producen in silico automatizadamente usando bases de datos computadorizadas No se necesita una biblioteca de cdna

15 El arreglo se sintetiza en la laminilla Deprotection son producidos mediante photodeprotection Permite añadir el nucleótido que se desea para producir una secuencia

16 Proteomics La abundancia de un mrna no es directamente proporcional a la abundancia de una proteína Post-transcriptional gene regulation Gran diversidad de proteínas después de trascripción Post-translational modifications (fosforilacion, glucosilacion) La abundancia de una proteína no determina su actividad Mayor complejidad

17 Proteome: la totalidad de las proteínas sintetizadas por una célula u organismo Proteomics: el estudio global de las proteínas Expresión, secuencia, abundancia, estructura, modificaciones, actividad, función, localización, interacción con otras moléculas El estudio es mas complicado que el de acidos nucleicos No hay sistema de amplificación selectiva Sistema de cinética predecible para detección (probes) Metodologías de estudio 2D- electrophoresis Liquid cromatography Mass spectrometry

18 2D First dimension isoelectric focusing Se lleva acabo en un gradiente de ph has que la proteína llega al punto isoelectrico El valor pi es equivalente al ph que lo rodeo, tiene carga neta 0 Second dimention Fraccionamiento por peso molecular (masa) La gel de enfoque isoelectrico se equilibra en una solución de SDS y se corre en una gel SDS-PAGE Después de fraccionacion se tiñe la proteína con Coomasie, nitrato de plata, tintes fluorescentes (mas sensitivos)

19 Se pueden separar 2,000-3,000 proteínas en un 2-D En levaduras 50% proteoma es constituido por el producto de 100 genes MS de 1 millón de copias por células de las proteínas mas abundantes Formatos grandes permiten mejor separación Se puede ajustar el rango de ph Comparaciones entre geles es muy complicada debido a variaciones en las condiciones de cada corrida

20 Liquid cromatography Permite separar proteínas antes o después de 2-D HPLC Permite separar muestras con grandes volumen Permite concentrar las proteínas Facilita estudiar proteínas que se expresan poco Separa proteínas y péptidos Puede ser unido al Massspect HPLC se utiliza como el paso final en multidimensional cromatography

21 Espectrometría de masa MS unido a algoritmos permitieron generar bases de datos basados en la masa de las proteínas y péptidos; Fingerprinting MS: se ioniza la muestra al vacío y se mide la masa de los iones resultantes Partes del MS: Ionizador: convierte el analito a iones en la fase gaseosa Analizador de masa: separa los iones de acuerdo a la masa Detector de iones

22 Estrategias para caracterizar proteínas: Peptide mass fingerprinting Electrospray ionization (ESI) or matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) Time of flight (TOF) analyzer La proteínas se digieren con una endopeptidasa como tripsina Se generan fragmentos específicos para cada proteína Se obtiene la masa de cada peptido Se analizan y comparan con las bases de datos de proteínas

23 Espectrometría de masa: técnica para determinar de forma especifica la masa molecular de los péptidos al calcular la proporción entre la masa y la carga del ion en el vacío Ionizacion suave: ionizacion de las proteínas sin romperlas MALDI: método de ionizacion suave. Se digiere la proteína y los peptidos se unen a una matriz que absorbe luz y se evaporan, forman cristales y se pasan a un vacío Un láser calienta la muestra hasta formar gas Se pasa una corriente para ionizar la muestra y se acelera hacia el detector

24 Electrosprat ionuzation (ESI) Método de ionizacion suave El analito de disuelve en un solvente y se pasa por un capilar Se aplica una carga al capilar produciendo gotitas (spray) que salen en la parte alta del capilar Las gotitas se evaporan al ser tocadas por un gas inerte caliente Se analizan por el analizador de masa Time of flight (TOF) Analizador de masa que determina la proporcion de masa a carga y mide el tiempo que le toma al analito viajar a través del tubo de vuelo hasta el detector

25 Cuantificación de proteínas mediante MS Se marcan las muestras de proteínas que han sido previamente separadas con un isótopo pesado y con un isótopo liviano Se unen las muestras Se separan por MS Se detecta la altura del pico el cual determina la cantidad del peptido In vivo labeling, pre-digestion labeling in vitro, postdigestion, postdigestion labeling.

26 Las modificaciones posttraduccionales se pueden detectar mediante MS MALDI-TOF Fosforilación: cada grupo fosfato (HPO3) añade 80 Da a la masa de la proteína Se utiliza fosfatasa alcalina para determinar si la diferencia se debe a fosforilación fosfopeptidos

27 Antibodies arrays Se pegan (inmovilizan) anticuerpos a la matriz Anticuerpos interaccionan con proteínas especificas Tienen alto poder de discriminación Se utiliza otro anticuerpo que reconoce también específicamente la proteína Tiene una enzima ligada Las proteínas no tienen que se marcadas Sandwich assay

28 Antigens arrays La proteína o antígeno se pega directamente a la matriz Se utiliza para ensayo inmunológico a la inversa Para detectar anticuerpos en solución Aptámeros: tienen alta especificidad por proteínas y otras molecular Interacciones de DNA-proteínas Interacciones de proteína-proteína