Proteoma mitocondrial de Saccharomyces cerevisiae

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Trinidad Montes Ríos
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1 Proteoma mitocondrial de Saccharomyces cerevisiae

2 PNAS, 23: (2003)

3 Mitocondria Orgánulos celulares presentes en casi todas las células eucariotas. La mitocondria desempeña un papel principal en múltiples funciones celulares: Bioenergética Apoptosis Metabolismo de ácidos grasos, lípidos, hierro Muchas enfermedades se atribuyen a defectos mitocondriales. El conocimiento de las funciones fisiológicas de la mitocondria es limitado, y muchas enfermedades mitocondriales no pueden ser analizadas a nivel molecular.

Metabolismo de ácidos grasos, lípidos, hierro Muchas enfermedades se atribuyen a defectos mitocondriales.

4 Mitocondria IM - membrana interna IMS- espacio intermembrana OM- membrana externa

5 Saccharomyces cerevisiae Hongo ascomiceto unicelular que se utiliza ampliamente en la elaboración de vino, cerveza, pan y otros alimentos. Muchos genes humanos implicados en enfermedades tienen homólogos en levaduras. Excelente accesibilidad de las levaduras al análisis genético y bioquímico. Principal organismo modelo para la identificación y caracterización de funciones proteicas y rutas celulares en eucariotas. Primer genoma eucariota completamente secuenciado: 12 Mb, organizado en 16 cromosomas.

Excelente accesibilidad de las levaduras al análisis genético y bioquímico.

6 Saccharomyces cerevisiae

7 Saccharomyces cerevisiae Foury F et al., "The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.", FEBS Lett, 1998 Dec 4;440(3): Bussey H et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XVI.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):103-5 Jacq C et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome IV.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):75-8 Dietrich FS et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome V.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):78-81 Tettelin H et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome VII.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):81-4 Dujon B et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XV.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl): Churcher C et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome IX.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):84-7 Philippsen P et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XIV and its evolutionary implications.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):93-8 Johnston M et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XII.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):87-90 Bowman S et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XIII.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):90-3 Goffeau A et al., "Life with 6000 genes.", Science, 1996 Oct 25;274(5287):546, Galibert F et al., "Complete nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome X.", EMBO J, 1996 May 1;15(9): Vassarotti A et al., "Structure and organization of the European Yeast Genome Sequencing Network.", J Biotechnol, 1995 Jul 31;41(2-3):131-7 Murakami Y et al., "Analysis of the nucleotide sequence of chromosome VI from Saccharomyces cerevisiae.", Nat Genet, 1995 Jul;10(3):261-8 Bussey H et al., "The nucleotide sequence of chromosome I from Saccharomyces cerevisiae.", Proc Natl Acad Sci U S A, 1995 Apr 25;92(9): Feldmann H et al., "Complete DNA sequence of yeast chromosome II.", EMBO J, 1994 Dec 15;13(24): Johnston M et al., "Complete nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome VIII.", Science, 1994 Sep 30;265(5181): Dujon B et al., "Complete DNA sequence of yeast chromosome XI.", Nature, 1994 Jun 2;369(6479):371-8 Oliver SG et al., "The complete DNA sequence of yeast chromosome III.", Nature, 1992 May 7;357(6373):38-46 Hartley JL, Donelson JE, "Nucleotide sequence of the yeast plasmid.", Nature, 1980 Aug 28;286(5776):860-5

", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):75-8 Dietrich FS et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome V.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):78-81 Tettelin H et al.

8 Objetivo Identificación de proteínas mitocondriales de S. cerevisiae El análisis del proteoma mitocondrial proporcionará una importante base de datos para: Análisis de funciones asociadas a la mitocondria Análisis de nuevas funciones mitocondriales Caracterización de enfermedades mitocondriales

importante base de datos para: Análisis de funciones asociadas a la

9 Purificación de mitocondrias Aislamiento de mitocondrias a partir de lisados celulares de S. cerevisiae mediante: Centrifugación diferencial Dos gradientes de sacarosa consecutivos Utilización de cuatro métodos de separación de proteínas en paralelo, para minimizar el problema de que una fracción significativa de proteínas pueda escapar a la detección: 1D-PAGE 2D-PAGE Digestión con 4 proteasas seguida de cromatografía líquida multidimensional (MDLC, multidimensional liquid cromatography) Generación de fracciones asociadas a mitocondrias mediante tratamiento con sales o tripsina.

$en paralelo, para minimizar el problema de que una fracción significativa de proteínas pueda escapar a la detección: 1D-PAGE 2D-PAGE Digestión con$

10 Separación de proteínas y análisis MS Mitocondrias purificadas: a. 2D-PAGE y MALDI-TOF-MS o n-lc-ms/ms (nano liquid chromatography-ms/ms). b. Cromatografía líquida multidimensional y ESI-MS. c. 1D-PAGE y n-lc-ms/ms. Fracciones asociadas a mitocondrias generadas mediante tratamiento con sales o tripsina: a. 1D-PAGE y n-lc-ms/ms. b. 1D-HPLC y n-lc-ms/ms. En total, se obtuvieron de más de 20 millones de espectros de masas que se analizaron posteriormente en las bases de datos.

Cromatografía líquida multidimensional y ESI-MS. c. 1D-PAGE y n-lc-ms/ms.

11 Separación de proteínas y análisis MS

12 Separación de proteínas y análisis MS Busqueda automática en la base de datos completa de S. cerevisiae utilizando el algoritmo SEQUEST. Identificación de un total de 750 proteínas mitocondriales diferentes en S. cerevisiae (aprox. 90% del total): indica la implicación de la mitocondria en múltiples procesos celulares. Análisis con el programa MitoProt: predicción de una presecuencia mitocondrial clásica en 320 proteínas (43%). Análisis con el programa TMHMM: predicción de al menos un segmento α-hélice transmembrana en 255 proteínas (34%).

90% del total): indica la implicación de la mitocondria en múltiples procesos celulares.

13 Separación de proteínas y análisis MS

14 Separación de proteínas y análisis MS Mediante 2D-PAGE se identificaron 209 spots, que permitieron la identificación de 109 proteínas diferentes: 13 proteínas tenían función desconocida. De las 750 proteinas mitocondriales identificadas: 436 proteínas (58%) mitocondriales conocidas 208 proteínas de función desconocida 106 proteínas previamente descritas como localizadas en otros compartimentos celulares. Se ha descrito una localización doble (mitocondria y otro compartimento celular) para al menos 30 proteínas mitocondriales conocidas.

De las 750 proteinas mitocondriales identificadas: 436 proteínas (58%) mitocondriales conocidas 208 proteínas de función desconocida

15 Cobertura del proteoma Identificación de todas las subunidades conocidas del complejo piruvato deshidrogenasa. Identificación de los complejos de la membrana interna de la maquinaria de fosforilación oxidativa. El estudio no está sesgado hacia proteínas de membrana. Tampoco está sesgado hacia proteínas pequeñas o grandes: distribución de los MWs de las proteínas identificadas. Las proteínas mitocondriales identificadas representan aprox. el 92% de las proteinas mitocondriales conocidas de S. cerevisiae en la base de datos MITOP.

El estudio no está sesgado hacia proteínas de membrana.

16 Cobertura del proteoma Difícil identificar el 100% de las proteínas de un organulo celular mediante un análisis proteómico. Algunas proteínas sólo se expresan en condiciones de crecimiento particulares, por lo que no existe una única condición de crecimiento en la que se expresen todas la proteínas simultaneamente. Además, algunas proteínas escapan a la detección mediante los métodos de separación e identificación disponibles. La identificación de proteínas mitocondriales en S. cerevisiae mediante la combinación de múltiples aproximaciones está próxima a la saturación.

que se expresen todas la proteínas simultaneamente.

17 Cobertura del proteoma Más de 650 proteínas mitocondriales identificadas con los primeros 5 millones de espectros. La mayor parte de las proteínas restantes identificadas en los siguientes 10 millones de espectros.

18 Clasificación funcional En base a las funciones conocidas o predichas de las proteinas mitocondriales, diferentes clases funcionales: Sólo un 14% de las proteínas actuan directamente en el metabolismo energético: Maquinaria de fosforilación oxidativa Ciclo del ácido tricarboxílico Piruvato deshidrogenasa Un 25% de las proteínas implicadas en el mantenimiento y la expresión del genoma mitocondrial. El 25% de la proteínas identificadas tiene una función desconocida.

fosforilación oxidativa Ciclo del ácido tricarboxílico Piruvato deshidrogenasa Un 25% de las proteínas implicadas en

19 Clasificación funcional

20 Perspectivas La base de datos del proteoma mitocondrial de S. cerevisiae representa una fuente global para estudios de: Caracterización de nuevas funciones mitocondriales. Caracterización de nuevas funciones asociadas a la mitocondria. Rutas de señalización. Sistemas proteolíticos. Identificación molecular de las bases de las enfermedades mitocondriales.

funciones mitocondriales. Caracterización de nuevas funciones asociadas a la mitocondria.

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