CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ESTUDIOS AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOQUÍMICA

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1 CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ESTUDIOS AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD DE BIOTECNOLOGÍA E INGENIERÍA GENÉTICA DE PLANTAS DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOQUÍMICA CAMPUS GUANAJUATO Caracterización molecular de fructanos en Agave y Dasylirion spp., identificación de fructosiltransferasas y su expresión en Pichia pastoris T E S I S QUE PRESENTA M.C. Norma Alejandra Mancilla Margalli COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS EN LA ESPECIALIDAD DE BIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS Irapuato, Guanajuato, México, 2006

2 Este trabajo titulado Caracterización molecular de fructanos en Agave y Dasylirion spp., identificación de fructosiltransferasas y su expresión en Pichia pastoris fue realizado en el Laboratorio de Química de Productos Naturales del Departamento de Biotecnología y Bioquímica del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados Campus Guanajuato, bajo la asesoría de la Dra. Mercedes G. López. ii

3 AGRADECIMIENTOS A la Dra. Mercedes G. López, por su asesoría, por e y especialmente por su inmensurable apoyo (científico, moral y económico). Oportuno que dirigió el A los sinodales Dr. Luis E. González de la Vara, Dr. John Paul Délano F, Dra. Ana Paulina Barba de la Rosa y Dr. Edgar Quero Gutiérrez, por sus valiosas aportaciones que enriquecieron el presente trabajo. Al CONACyT, por apostarle a la ciencia y ayudar económicamente a estudiantes que desean un México competitivo. A todo el personal del Cinvestav-Guanajuato, al área administrativa (Dora Elia Anguiano), de intendencia (Daniel y Bertha) y de biblioteca (Mary Carmen Ruíz) por su trato amable y su trabajo siempre oportuno y eficiente. Al Prof. Sjef Smeekens, de la Universidad de Utrecht, Holanda, por brindarme amablemente la oportunidad de explorar en su laboratorio un campo científico nuevo para mí. A Tita Ritsema por sus finas atenciones y la paciencia con la que compartió y dirigió parte de este trabajo. Al Gobierno de los Países Bajos por el otorgamiento de la Beca Huygens que me permitió realizar una estancia doctoral en la Universidad de Utrecht. Al CONACyT por el otorgamiento de una beca mixta, que sin lugar a dudas, fue de bastante provecho para la calidad de la presente investigación. A la Dra. Petra Mischnick de la Universidad Técnica de Braunschweig, Alemania, por su apoyo y asesoría en la química de carbohidratos. iii

4 A la Dra. Ana Paulina Barba de la Rosa del Instituto Potosino de Investigaciones Científicas y Tecnológicas, por la oportunidad de hacer mil intentos en su laboratorio. A mis amigos del laboratorio: Lulú Macías, Blanca Aguilar, María Luisa Martínez, Tere Carrillo, Isadora Jiménez, Octavio Carrillo, Claudia y Judith Urias, por su apoyo y entusiasmo contagiante. A Tita Ritsema, Auke Verhaar, Fatima Rahmani, Anja van Dijken, Marcel Proveniers, Jolanda Schuurmas, Anika Wiese, Henriette Schluepmann y Bas Dekkers, por su hospitalidad, por mostrarme las maravillas de su país y por hacerme sentir como en casa en un lugar con una cultura diferente A mis cubanos Lázaro Hernández, Yanetsi Borroto, Yanet Tambara, José Angel y Rolando, porque su hermandad y cariño me han servido de soporte. A mis amigos de siempre Lorena, Jimmy, Isis, Pedro y Lulú, por su longeva amistad. A mis papás, José Trinidad y Norma Ofelia, por su gran cariño y apoyo incondicional. A mis hermanos, Popo, Pity, Betito y Kiko, por toda la vida recorrida. A mi esposo, Juan, por todo su amor y por los momentos compartidos. A mis abuelitos, tíos y primos. A la pequeña Ana y Caellou, por llenar de alegría nuestras vidas. iv

5 ÍNDICE Página I. RESUMEN 1 II. INTRODUCCIÓN 2 III. OBJETIVOS 5 IV. ANTECEDENTES AGAVES Y DASYLIRION 1.1. Clasificación taxonómica Agavaceae Nolinaceae Distribución Descripción de los géneros y características delimitantes de las familias Agavaceae y Nolinaceae Agave Agave tequilana Weber var. azul Agave angustifolia Haworth Agave potatorum Zuccarini Agave cantala Agave fourcroydes Dasylirion Importancia económica y científica Usos tradicionales Usos ornamentales Obtención de fibras naturales Obtención y caracterización de fitoquímicos Elaboración de bebidas alcohólicas Bebidas fermentadas Bebidas destiladas Elaboración de edulcorantes fructosados Utilización del bagazo Propagación in vitro Influencia de la zona geográfica en los agaves Adaptación de los agaves Adaptación morfológica Hojas Raíces Tallo Adaptación fisiológica Metabolismo ácido de las crassulaceas (CAM) Bioquímica del metabolismo ácido de las crassulaceas (CAM) Acumulación de fructanos 39 FRUCTANOS 2.1. Estructura Métodos analíticos Especificidad estructural Metabolismo 45 v

6 Complejidad metabólica Caracterización bioquímica Caracterización molecular Familia GH Fisiología de los fructanos Carbohidratos de reserva Desarrollo vegetal Defoliación Descarga apoplástica Ajuste osmótico Tolerancia al frío Tolerancia a sequía Defensa contra patógenos Potencial biotecnológico de los fructanos 71 V. JUSTIFICACIÓN 73 VI. HIPÓTESIS 73 VII. MATERIALES Y MÉTODOS 74 A) Material Biológico 1. Regiones Edad Muestreo 74 B) Metodología 1. Comparación y caracterización estructural de carbohidratos de almacén en agaves y dasylirion 1.1. Determinación espectrofotométrica Extracción de carbohidratos totales Determinación de carbohidratos totales Determinación de D-glucosa, D-fructosa y sacarosa Determinación de fructanos Determinación de almidón Extracción de fructanos Caracterización de fructanos Cromatografía en capa fina Cromatografía líquida de alta resolución Derivatización de fructanos a alditol acetatos parcialmente metilados Caracterización de fructanos de Agave tequilana Espectrometría de masas por ionización/desorción por láser asistida por una matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF-MS) Resonancia magnética nuclear de carbono Resonancia magnética nuclear de protón Identificación de actividades enzimáticas involucradas en el metabolismo de fructanos 2.1. Extracción de proteínas Estrategias de purificación Cromatografía de afinidad Cromatografía de intercambio aniónico 90 vi

7 Cromatografía de hidroxiapatita Cromatografía de exclusión en gel Cuantificación de proteínas Ensayos enzimáticos Separación electroforética Identificación y aislamiento de secuencias codificantes de enzimas del metabolismo de fructanos de agave y su expresión en Pichia pastoris 3.1. Aislamiento e identificación de secuencias codificantes Extracción de ácido ribonucleico (ARN) Geles de agarosa Electroforesis en microchip Obtención de secuencias complementarias por transcripción reversa Diseño de oligonucleótidos iniciadores Amplificación de secuencias complementarias Elución y purificación de ácido desoxiribonucleico (ADN) a partir de bandas de agarosa Preparación de células competentes Clonación y transformación Purificación de plásmidos Confirmación de la secuencia en el plásmido Identificación de las secuencias Aislamiento de ADNc completo de la secuencia Amplificación rápida del extremo 5 del ADN complementario (5 -RACE) Amplificación rápida del extremo 3 del ADN complementario (3 -RACE) Ligación y clonación del ADNc completo Expresión en Pichia pastoris Eliminación del péptido señal y secuencia de terminación Propagación del vector Transformación de Pichia pastoris y análisis de expresión 107 VIII. RESULTADOS 1. Comparación y caracterización estructural de carbohidratos de almacén en agaves y dasylirion 1.1. Patrón de carbohidratos no estructurales Factores ontogénicos Influencia del ambiente en el patrón de carbohidratos no estructurales Función de los fructanos en la sequía Presencia de almidón Perfil cromatográfico de fructanos Cromatografía en capa fina Cromatografía líquida de alta resolución Análisis de enlaces por derivatización Cuantificación de los glicosil-derivados Significancia de la diversidad estructural de fructanos Caracterización de fructanos de A. tequilana Espectrometría de masas por ionización/desorción por láser asistida por una matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF-MS) Resonancia magnética nuclear de carbono vii

8 Resonancia magnética nuclear de protón Estructuras propuestas para fructanos en Agave y Dasylirion Posibles implicaciones de la presencia de fructanos en agaves y dasylirion Identificación de actividades metabólicas involucradas en el metabolismo de fructanos de agave y dasylirion 2.1. Estrategia Cromatográfica I Cromatografía de afinidad Cromatografía de intercambio aniónico Cromatografía de hidroxiapatita Cromatografía de exclusión en gel Identificación putativa de enzimas involucradas en el metabolismo de fructanos Estrategia Cromatográfica II Extracto crudo Cromatografía de intercambio aniónico Cromatografía de afinidad Actividades fructosiltransferasas identificadas en agaves y dasylirion Aislamiento e identificación de secuencias codificantes de enzimas del metabolismo de fructanos de agave y su expresión en Pichia pastoris 3.1. Extracción de ácido ribonucleico Amplificación de fragmentos de ácido desoxiribonucleico complementario (ADNc) a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Identidad de los fragmentos amplificados Amplificación del ADNc completo de la fructosiltransferasa de Agave tequilana (atft) Amplificación de los extremos terminales 3 y Determinación de la orientación de los insertos en el vector Ligación del ADNc completo de atft Análisis de la secuencia atft Uso de codones del ADNc de atft Identificación de la proteína madura Glicosilhidrolasa Expresión heteróloga de atft Construcción del vector pgapzαc-atft Análisis de expresión Identidad de la AtFT 192 IX. CONCLUSIONES 195 X. PERSPECTIVAS 196 XI. APÉNDICES A.- Preparación de soluciones 198 B.- Análisis de fragmentación de alditol acetatos parcialmente metilados (PMAA) 200 C.- Desplazamientos químicos de 13 C-fructanos 207 D.- Secuencias aisladas 212 XII. REFERENCIAS 217 viii

9 ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1. Mayahuel 6 Figura 2. Clasificación taxonómica de Agave y Dasylirion 8 Figura 3. Características morfológicas de miembros de la familia Agavaceae y Nolinaceae 11 Figura 4. Distribución de las familias Agavaceae y Nolinaceae 12 Figura 5. Edulcorante fructosado Naturel 23 Figura 6. Influencia de factores abióticos en la asimilación de CO 2 en A. lechuguilla 26 Figura 7. Influencia de la temperatura en la asimilación de CO 2 en A. tequilana 27 Figura 8. Áreas óptimas, subóptimas y marginales para el cultivo de A. tequilana en Jalisco 28 Figura 9. Cambios en la velocidad de respiración durante sequía en raíces de lluvia y establecidas en A. deserti 32 Figura 10. Diferencia de temperatura entre el área foliar (de maíz o agave) y el aire circundante 33 Figura 11. Metabolismo ácido de las crassulaceas 35 Figura 12. Estrategias de flujo de carbono propuestas para especies CAM 38 Figura 13. Unidades estructurales de los fructanos 42 Figura 14. Rango de grados de polimerización (DP) en especies que acumulan fructanos 45 Figura 15. Diferentes vías biosintéticas de fructanos en plantas superiores 48 Figura 16. Regulación de la actividad de fructosiltransferasas 54 Figura 17. Alineamiento de proteínas pertenecientes a las familias GH32 y G68 57 Figura 18. Mecanismos catalíticos de las glicosilhidrolasas 59 Figura 19. Papel de las fructosiltransferasas en el desarrollo de plantas superiores 61 Figura 20. Efecto de la defoliación en el metabolismo de fructanos 63 Figura 21. Metabolismo de fructanos en Avena sativa bajo estrés por frío 66 Figura 22. Fructanos en estrés por sequía 68 Figura 23. Modelo propuesto de la participación de fructanos en la resistencia a patógenos 70 Figura 24. Esquema general de trabajo 76 Figura 25. Programa de elución utilizado en la separación cromatográfica de fructanos de Agave y Dasylirion 83 Figura 26. Metodología de derivatización de carbohidratos a PMAA 85 Figura 27. Diseño de oligonucleótidos degenerados 98 Figura 28. Vector pgem-t Easy 100 Figura 29. Amplificación de los extremos de ADNc mediado por ARN ligasa (RLM-RACE) 102 Figura 30. Mapa del vector pgapzαc 105 Figura 31. Contenido de carbohidratos no estructurales solubles 109 Figura 32. Presencia de almidón en especies de Agave y Dasylirion 115 Figura 33. Cromatografía en capa fina de fructanos de Agave y Dasylirion 117 Figura 34. Perfil cromatográfico (HPAEC-PAD) de fructanos de agave comparados con fructanos de achicoria (tipo inulina) y cebolla (neofructanos) 119 Figura 35. Perfil de elusión, utilizando cromatografía de gases, de fructanos de Agave y Dasylirion derivatizados a alditol acetatos parcialmente metilados 122 Figura 36. Comparación de fructanos derivatizados en tres especies vegetales 123 Figura 37. Cuantificación de los glicosil-derivados en fructanos de las especies analizadas 127 Figura 38. Espectro de masas MALDI-TOF-MS de fructanos de A. tequilana 131 Figura 39. Espectro de 13 C-RMN de fructanos de A. tequilana 131 Figura 40. Espectros de 13 C-RMN de fructanos en Asparagales 135 Figura 41. Espectro de 1 H-RMN de sacarosa y fructanos de Dahilia variabilis y Agave tequilana 136 Figura 42. Estructuras propuestas para fructanos presentes en Agave y Dasylirion 139 Figura 43. Cromatografía de afinidad a concanavalina A 142 ix

10 Figura 44. Cromatografía de intercambio aniónico 144 Figura 45. Cromatografía de hidroxiapatita 146 Figura 46. Cromatografía de exclusión en gel 148 Figura 47. Electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante 150 Figura 48. Perfil cromatográfico de fructanos sintetizados por el extracto crudo de A. potatorum 152 Figura 49. Cromatografía de intercambio aniónico 156 Figura 50. Actividades hidrolíticas de la fracción Q0 157 Figura 51. Perfil cromatográfico de productos del ensayo enzimático de las fracciones de intercambio aniónico de A. potatorum 158 Figura 52. Productos de la acción enzimática de las fracciones afines a concanavalina A 160 Figura 53. Modelo propuesto para la biosíntesis de fructanos en Agave y Dasylirion 162 Figura 54. Extracción de ARN 164 Figura 55. Amplificación de fragmentos con oligonucleótidos degenerados 165 Figura 56. Análisis de restricción de productos amplificados con oligonucleótidos degenerados 166 Figura 57. Dendograma de secuencias alineadas de fructosiltransferasas 168 Figura 58. Alineamiento de los fragmentos amplificados de A. tequilana con enzimas relacionadas al metabolismo de fructanos 170 Figura 59. Amplificación rápida de los extremos del DNAc de atft mediado por la ARN ligasa 173 Figura 60. Orientación de los insertos At5 - y At3 -RACE en el vector pgem-t Easy 175 Figura 61. Estrategia de clonación para la obtención del plásmido pgem T-atft 177 Figura 62. Digestión y análisis de restricción 178 Figura 63. Árbol filogenético sin raíz de enzimas del metabolismo de fructanos 179 Figura 64. Predicción del péptido señal en AtFT 182 Figura 65. Alineamiento de AtFT con Inv-V y FT 184 Figura 66. Perfil cromatográfico de productos generados de AtFT excretada al medio Extracelular 190 Figura 67. Perfil cromatográfico de los productos generados de AtFT contenida en la fracción celular 192 x

11 ÍNDICE DE TABLAS Página Tabla 1. Clasificación de subgéneros y grupos de Agave 9 Tabla 2. Composición del aguamiel y pulque 21 Tabla 3. Productividad anual de agaves y otras plantas CAM 25 Tabla 4. Rangos de temperatura para el cultivo de A. tequilana en Jalisco 29 Tabla 5. Tolerancia de agaves y dasylirion a frío extremo 29 Tabla 6. Susceptibilidad a la cavitación de A. tequilana y A. deserti sometidos a sequía 31 Tabla 7. Comparación de parámetros fisiológicos de Zea mays y Agave americana 34 Tabla 8. Clasificación taxonómica y comportamiento CAM de algunas especies estudiadas 37 Tabla 9. Ocurrencia de fructanos en Angiospermas 41 Tabla 10. Predominancia estructural de fructanos según la especie 46 Tabla 11. Propiedades cinéticas de distintas fructosiltransferasas 51 Tabla 12. Muestreo de especies de Agave y Dasylirion 75 Tabla 13. Determinación enzimática de D-glucosa, D-fructosa y sacarosa 78 Tabla 14. Secuencia de los oligonucleótidos utilizados 96 Tabla 15. Identificación de fructanos eluídos en un sistema cromatográfico intercambio aniónico de alta resolución (HPAEC-PAD) 120 Tabla 16. PMAA en fructanos de Agave y Dasylirion spp., Dahlia variabilis y Allium cepa 125 Tabla 17. Contribución relativa de compuestos derivatizados en los fructanos 128 Tabla 18. Correlación entre diferentes compuestos derivatizados 128 Tabla 19. Desplazamientos químicos de 13 C-RMN de fructanos 133 Tabla 20. Desplazamientos químicos de 1 H-RMN de fructanos 137 Tabla 21. Calibración de la columna de exclusión y estimación de pesos moleculares de las fracciones proteínicas 149 Tabla 22. Productos formados en los bioensayos con fracciones Q y usando sacarosa o 1- kestotriosa como sustrato 153 Tabla 23. Secuencias de enzimas relacionadas al metabolismo de fructanos 167 Tabla 24. Uso de codones en el ADNc de atft 181 xi

12 ABREVIATURAS UTILIZADAS DEPC Dietil pirocarbonato d.i. Diámetro interno datp Adenosin desoxitrifosfato dctp Citocin desoxitrifosfato dgtp Guanidin desoxitrifosfato DMSO Dimetil sulfóxido dntp Mezcla de datp, dctp, dgtp y dttp dttp Tiamin desoxitrifosfatos DTT Ditiotreitol e.r.c. Respuesta efectiva de carbono (effective response of carbon) EPI Índice productivo ambiental (environmental productive index) FOS Fructo-oligosacáridos GC-FID Cromatografía de gases acoplado a detector de ionización en flama (gas chromatography coupled to flame ionization detector) GC-MS Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (gas chromatography coupled to mass spectrometry) GH Glicosilhidrolasa HPAEC-PAD Cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución acoplado a detector de pulso amperométrico (high performance anionic exchange chromatography-pulse amperometric detector) HPLC Cromatografía líquida de alta resolución (high performance liquid chromatography) Inv-CW Invertasa de pared celular (invertase-cell wall) Inv-V Invertasa vacuolar IOS Inulo-oligosacáridos KD Coeficiente de distribución de la masa molecular Kh Conductividad hidráulica 1-KES 1-Kestotriosa (O-α-D-Glcp-(1-2)-O-β-D-Fruf-(2-1)-β-D-Fruf) 6-Kes 6-Kestotriosa (O-α-D-Glcp-(1-2)-O-β-D-Fruf-(6-2)-β-D-Fruf) 6G-Kes 6-Glucosa-kestotriosa o neokestosa (O-β-D-Fruf-(2-6)-O-α-D-Glcp-(1-2)-β-D-Fruf) 6-KES 6-Kestosa exohidrolasa PAHBAH Hidracida del ácido p-hidroxibenzoico PAR Radiación fotosintéticamente activa (photosynthetically active radiation) PCR Reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction) PH Process hardiness PMAA Alditol acetato parcialmente metilado (partially methylated alditol acetate) RMN Resonancia magnética nuclear TAE Buffer Tris-HCl 40 mm, ácido acético 20 mm, EDTA 1mM TE Buffer Tris-HCl 10 mm, EDTA 1 mm, ph 8.0. TFA Ácido trifluoroacético (Trifluoroacetic Acid) TLC Cromatografía en capa fina (thin layer chromatography) xii

13 I. RESUMEN Los agaves son parte del 15% de plantas superiores que almacenan fructanos, polímeros de fructosa sintetizados a partir de la acumulación de sacarosa en la vacuola. Existen cinco tipos estructurales de fructanos, según la manera en que los residuos β-d-fructofuranosa son transferidos por las fructosiltransferasas, enzimas involucradas en su metabolismo. La acumulación de algún tipo de fructanos parece depender de la especie, y la presencia de éstos se sugiere importante en la tolerancia a distintos tipos de estrés abiótico. En el presente trabajo se caracterizó la estructura de fructanos y se comparó el patrón de carbohidratos no estructurales en varias especies de agave, crecidas en distintas regiones climáticas; incluyendo, además, a Dasylirion spp., una especie poco estudiada pero morfológica y taxonómicamente relacionada con los agaves. El contenido de fructanos en los tallos de agave fue superior al 60% (peso seco) y dasylirion acumuló solo el 17%; mientras que, el almidón en estas especies no representó más del 2%. Las diferencias entre especies fueron cuantitativas más que cualitativas, encontrándose una correlación de la concentración de fructanos y aquellos involucrados en su metabolismo (fructosa, glucosa, sacarosa) con las condiciones ambientales donde estas plantas fueron colectadas (por ejemplo, más fructosa en plantas colectadas en regiones áridas). La diversidad de fructanos fue evidenciada por técnicas cromatográficas (TLC, HPAEC-PAD) y espectroscópicas de alta resolución (NMR, MALDI-TOF-MS), que permitieron proponer estructuras complejas, hasta ahora no reportadas, que hemos denominado agavinas. La diversidad estructural coincidió perfectamente con las diferentes actividades fructosiltransferasa identificadas en un extracto proteínico de Agave tequilana, que utilizando sacarosa como único sustrato, produjo un perfil de fructanos semejante a lo observado in vivo. A través de distintos pasos cromatográficos se llegó a un enriquecimiento de la actividad de enzimas involucradas en el metabolismo de fructanos en agaves. Finalmente, se aisló un ADNc de Agave tequilana con una mayor homología a la enzima fructan:fructan-6-glucosa-fructosiltransferasa (6G-FFT) reportada en espárrago y cebolla; sin embargo, su expresión en el sistema de expresión de Pichia pastoris, evidenció una principal actividad de 1-fructan:fructan fructosiltransferasa (1-FFT). Éste constituye el primer ADNc aislado en la importante familia Agavaceae y el primer 1-FFT del orden Asparagales. 1

14 II. INTRODUCCIÓN Los fructanos son carbohidratos de reserva sintetizados por solo el 15% de las plantas superiores, y aunque han sido tópico de investigación desde hace 200 años aproximadamente, hay aspectos estructurales, fisiológicos y evolutivos que aún faltan por ser elucidados. La presencia de fructanos en agaves es reportada desde la década de los años 50 y 70; sin embargo, estos estudios son limitados a Agave vera cruz, una especie que crece en la región de Asia y actualmente está casi extinta. Solo recientemente, la investigación de fructanos en agave ha resurgido, enfocándose principalmente a Agave tequilana, especie de gran relevancia industrial en nuestro país, debido a que la hidrólisis de sus fructanos constituye el sustrato fermentable en la producción de tequila. Los fructanos son polímeros de fructosa que se sintetizan en la vacuola como respuesta a una acumulación de sacarosa en este organelo. Las fructosiltransferasas (FT), enzimas que participan en su metabolismo, adicionan residuos de β-d-fructofuranosa a una unidad de sacarosa utilizada como aceptor inicial. Los cinco tipos estructurales de fructanos descritos hasta ahora, son resultado de las distintas formas en que las diversas enzimas transfieren los residuos de fructosa. La 1-sacarosa:sacarosa-fructosiltransferasa (1-SST), es la enzima inicial que transfiere una unidad de fructosa de una molécula de sacarosa a otra. La 1-kestotriosa así formada (G-F-F), es el metabolito central utilizado por las demás FT en la síntesis de fructanos superiores. La 1- fructan:fructan-fructosil-transferasa (1-FFT) elonga el polímero mediante enlaces β(2-1), generando el fructano conocido como inulina; la 6-SFT sintetiza levanos, esto es, polímeros lineales con enlaces β(2-6) o introduce este tipo de enlace en una molécula de inulina existente, produciendo los graminanos o fructanos ramificados; por su parte, la fructan:fructan-6-glucosafructosiltransferasa (6G-FFT) transfiere residuos de fructosa al carbono 6 de la glucosa, generando los denominados neofructanos (inulina- o levano-neoserie, dependiendo del enlace), caracterizados por tener una unidad de glucosa entre dos moléculas de fructosa. Finalmente, en el metabolismo de estas biomoléculas, además participan la fructan exohidrolasa (FEH) y la invertasa vacuolar (Inv-V). La primera enzima degrada los polímeros hidrolizando la fructosa localizada en un extremo; mientras que el papel de la Inv-V es controversial en el análisis metabólico de estos carbohidratos, ya que es capaz de sintetizar o hidrolizar algunos fructanos dependiendo de las condiciones de reacción. 2

15 La acumulación de un tipo específico de fructanos parece seguir un patrón que depende de la especie, por lo que se ha sugerido que la determinación estructural de fructanos puede utilizarse como criterio adicional en la clasificación taxonómica de las especies. Por otra parte, aunque no hay un mecanismo completamente entendido, existen evidencias experimentales que sugieren la importancia de los fructanos en la tolerancia de algunas especies a distintos tipos de estrés abiótico, como sequía, frío o salinidad, o en una mayor resistencia contra organismos patógenos, como los hongos Thyphula incarnata, T. ishikariensis y Microdochimm nivale. Las implicaciones evolutivas de los fructanos y de su diversidad estructural están lejos de ser claras; sin embargo, algunos autores coinciden que la disponibilidad limitada de agua, fue el principal factor climático que dio origen a las plantas que acumulan este tipo de carbohidratos. El orden Asparagales, donde se incluye a las familias Agavaceae y Nolinaceae, contiene especies sintetizadoras de fructanos ampliamente distribuidas en distintos ecosistemas. Este orden no es considerado altamente evolucionado, como los demás órdenes que almacenan fructanos. Adicionalmente, los restos más antiguos de plantas que sintetizan estos polímeros, corresponden a una flora que parece ser el ancestro de los agaves actuales. La sorprendente capacidad de los agaves para desarrollarse en ambientes hostiles, además de las características morfológicas (hojas suculentas) y fisiológicas (metabolismo CAM) especializadas para la supervivencia en condiciones de sequía, permite la especulación de que el metabolismo de fructanos pudo haber sido un factor adicional importante en la adaptación de la flora ancestral, y que actualmente sigue jugando un papel destacado en el desarrollo de los agaves en ambientes áridos, caracterizados por una limitación importante de agua. En el intento de lograr un mejor entendimiento de la fisiología de los fructanos y su implicación en el mecanismo de tolerancia al estrés abiótico de la sequía en agaves, en el presente trabajo se determinaron las características estructurales de los fructanos almacenados por cinco especies de agave crecidas en distintas regiones geográficas de la República Mexicana, con la finalidad de encontrar una posible correlación entre la concentración y tipo de fructanos con las características climáticas donde se establecen las especies estudiadas. Se incluyó además, especies silvestres de Dasylirion (de la familia Nolinaceae), para buscar una posible distinción estructural debida a la diferencia de géneros. De acuerdo a nuestro conocimiento, es la primera vez que la presencia y caracterización de fructanos en Dasylirion spp. es analizada a profundidad. Así mismo, se identificaron las principales actividades enzimáticas involucradas en la síntesis de fructanos y se 3

16 aisló el ADNc de una fructosiltransferasa, en el primer intento de encaminar las futuras investigaciones al estudio de la regulación del metabolismo de fructanos en Agavaceae. Un mejor conocimiento de la estructura de fructanos y la regulación de su metabolismo en Agave y Dasylirion, pueden generar perspectivas en el conocimiento científico y en sus aplicaciones biotecnológicas. 4

17 III. OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Caracterizar los fructanos presentes en especies de Agave y Dasylirion spp,, identificar las principales enzimas involucradas en su metabolismo y aislar sus secuencias codificantes. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Caracterizar y comparar la estructura de carbohidratos de almacén en cinco especies de Agave y Dasylirion spp. y correlacionarla con las características climáticas de las regiones donde crecieron las plantas. 2. Identificar las principales actividades enzimáticas involucradas en el metabolismo de fructanos en estas especies. 3. Aislar el ADNc de las principales enzimas involucradas en el metabolismo de fructanos de Agave tequilana Weber var. azul. 5

18 IV. ANTECEDENTES 1.- AGAVES Y DASYLIRION Los agaves y algunos miembros de la familia Nolinaceae, como Dasylirion spp., son plantas que han acompañado al hombre a lo largo de su historia y evolución, desde los primeros pobladores mesoamericanos hasta la actualidad. En tiempos prehispánicos, metl (agave en náhuatl, que también incluye a Dasylirion y especies relacionadas, Gentry, 1998) fue considerado como un regalo de los dioses, la primera planta que éstos habían creado y su importancia para estas sociedades, es evidente en su legado de códices y pinturas rupestres, donde Mayahuel, la diosa del agave, es fácilmente identificable por sus pencas, su inflorescencia estilizada y el espumoso pulque sobre su cabello o en una vasija entre sus manos (Figura 1) (Gentry, 1998). Agave y Dasylirion han sido cultivos claves, componentes primarios de productividad en virtualmente cualquier tipo de zona agrícola, desde tierras altas, productivas y de alta humedad, hasta aquellas zonas secas e infértiles donde en ocasiones son cultivos dominantes o exclusivos (Parsons y Darling, 2000) CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA Los miembros de las familias Agavaceae y Nolinaceae presentan un alto grado de convergencia morfológica, lo que dificulta el estudio de su evolución y taxonomía (Eguiarte, 1995). Figura 1. Mayahuel. Representación prehispánica de la deidad del agave. Mayahuel representa la fertilidad, una diosa que alimenta con sus 400 pechos a sus 400 hijos, todos ellos dioses de la embriaguez. 6

19 La divergencia evolutiva de los agaves parece haber sucedido hace 60 millones de años, durante el Eoceno; mientras que la separación entre Agavaceae sensu stricto y Nolinaceae habrá ocurrido hace 47 millones de años, se calcula que su dispersión fue hace 35 millones de años, y que sus tallos y hojas suculentas son características más recientemente adquiridas (Eguiarte, 1995; Nobel, 1998) AGAVACEAE Carlos Linneo estableció el género Agave en 1753 describiendo cuatro especies: A. americana, A. vivipara, A. foetida (ahora en el género Furchraea) y A. virginica (ahora en el género Manfreda) (Gentry, 1998). La familia Agavaceae fue creada en 1836 por el botánico australiano Stephen Endlicher incluyendo el género Agave y Furcraea. Richard A. Salisbury en 1866 dividió la familia en dos secciones: agaves con ovario súpero donde el género Yucca estaba incluido y aquellos con ovario ínfero, donde se incluyeron a los géneros Agavaea, Furcraea, Littaea, Manfreda y Polianthes. Sin embargo, como lo manifestó en 1871 Joseph Hooker, la familia ha sido difícil de clasificar, dada la amplia distribución, presencia de híbridos, tardanza de la emergencia floral (8-50 años) y variabilidad de estas especies dependiendo de la geografía y el clima (Peña-Álvarez et al., 2004). Una discrepancia en la clasificación esta dada por la semejanza en la estructura floral, propiedades de tejido y compuestos químicos con algunos miembros de la familia Amaryllidaceae (sábila), Alliaceae (cebolla) y Asparagaceae (espárrago) (Nobel, 1998). Actualmente, la clasificación reportada por Dahlgren, Clifford y Jeo (1985) es la más aceptada. En un análisis de monocotiledóneas basado en el número cromosomal, análisis anatómico, químico, biogeográfico y cladísitico, proponen al orden Asparagales con 30 familias, incluyendo Agavaceae, Nolinaceae, Asparagaceae, Dracaenaceae, Alliaceae y Amarallidaceae (Figura 2). Describen a la familia Agavaceae como restringida al continente americano y dividida en dos subfamilias: Yuccoideae, con ovario súpero (Yucca y Hesperalöe) y Agavoideae con ovario ínfero (Agave, Beschorneria, Furcraea, Manfreda, Polianthes y Prochnyanthes). Esta clasificación es apoyada por análisis palinológicos y secuencias del ADN cloroplástico del gen rbcl (subunidad grande de la Rubisco) (Ojeda y Ludlow, 1995; Eguiarte, 1995). En la subfamilia Agavoideae, el género Agave es el más importante y fue dividido por Gentry (1982) en dos subgéneros y grupos de acuerdo a su inflorescencia (Tabla 1): Littaea, con un órgano floral espigado y Agave, cuya inflorescencia es paniculada y con ramificaciones (Figura 3). 7

20 NOLINACEAE La familia Nolinaceae fue propuesta en 1936 por el botánico japonés Takenoshin Nakai, pero ésta no fue aceptada hasta 1985, cuando Dahlgren y col. reconocieron dicha separación e incluyeron en la familia Nolinaceae a los géneros Beaucarnea, Calibanus, Dasylirion y Nolina (Figura 2), todos ellos con ovario súpero y al parecer, ésta es una familia de origen monofilético, actualmente con 55 especies y 60 taxa. DIVISIÓN Angisoperma CLASE Liliopsida Magnoliopsida (Monocotiledonae) (Dicotiledonae) ÓRDEN Asparagales Otros órdenes FAMILIA Agavaceae Nolinaceae Otras 28 familias* SUBFAMILIA Agavoideae Yuccoideae GÉNERO Beschorneria Yucca Beucarnea Furcraea Hesperalöe Calibanus Manfreda Nolina Polianthes Dasylirion Prochynathes Agave SUBGÉNERO Littaea (8 secciones) Agave (12 secciones) Figura 2. Clasificación taxonómica de Agave y Dasylirion. Clasificación propuesta por Dahlgren, Clifford y Jeo en *Alliaceae, Amaryllidaceae, Anthericaceae, Aphyllanthaceae, Asparagaceae, Asphodelaceae, Asteliaceae, Blandfordiaceae, Calectasiaceae, Convallariaceae, Cyanastraceae, Dasypogonaceae, Dracaenaceae, Doryanthaceae, Eriospermaceae, Funkiaceae, Hanguanaceae, Hemerocallidaceae, Herreriaceae, Hyacinthaceae, Hypoxidaceae, Ixioliriaceae, Luzuriagaceae, Philesaciae, Phormiaceae, Ruscaceae, Tecophilaeaceae, Xanthorrhoeaceae. 8

21 Tabla 1. Clasificación de subgéneros y grupos de Agave. Subgénero Grupos Características No. Ejemplos especies Littaea Amolae* acaulescentes 8 attenuata, bakeri, pedunculifera, chrysoglossa, ocahui, vilmoriniana, yuccaefolia Choritepalae* especies pequeñas, 3 bracteosa, ellemeetiana, Filiferae* Marginatae tepalos separados hojas largas filíferas, limitados a la Sierra Madre Occidental pequeñas flores, largos tepalos Parviflorae pequeñas flores altamente especializada alto contenido de sapogeninas Polycephalae* hojas y flores de suave suculencia, dientes pequeños Striatae* hojas aserradas, flores y tepalos pequeños Urcerolate tamaño pequeño, flores pequeñas en forma de urna Agave Americanae flores amarillas de pedicelo largo Campaniflorae* Crenatae Deserticolae Ditepalae Hiemiflorae rosetas cortas, hojas largas verdes márgenes mamilados, panícula estrecha hojas rígidas fibrosas, lanceoladas, y dientes débiles, panícula delgada panícula abierta, tepalos cortos dimórficos flores agrupadas en forma esférica en una panícula delgada guiengola 7 colimana, felgeri, filifera, geminiflora, multifilifera, ornithobroma, schidigera 21 albomarginata, ensifera, ghiesbreghtii, horrida, kerchovei, lechuguilla, lophanta, pelona, pumilla 4 parviflora, polianthiflora, schotti, toumeyana 5 celsii, chiapensis, pendula, polyacantha, warelliana 3 dasyliroides, striata, stricta 2 arizonica, utahensis 6 americana, franzosini, lurida, oroensis, scabra, scaposa 3 aurea, capensis, promontorii 7 bovicornuta, calodonta, cupreata, hookeri, inaequidens, jaiboli, maximiliana 10 avellanidensis, cerulata, deserti, gigantensis, margaritae, mckelveyana, moranni, sobria 10 applanata, chrysantha, colorata, flexispina, fortiflora, murpheyi, palmeri 12 atrovirens, congesta, hiemiflora, hurteri, lagunae, pachycentra, potatorum 9

22 Marmoratae* pocas hojas escabrosas, espina pequeña 4 gypsophila, marmorata, nayaritensis, zebra Parryanae roseta globosa, compacta, hojas cortas, anchas, dientes conspicuos hacia la hoja 6 gracilipes, guadalajarana, havardiana, neomexicana, parrasana, parryi Rigidade hojas delgadas rígidas, dispuestas en espiral, bracteas pequeñas, abiertas poco ramificadas 12 aktites, angustifolia, cantala, fourcroydes karwinskii, macroacantha, tequilana Salmianae largas rosetas verdes suculentas forma piramidal en la base de la panícula 5 macroculmis, mapisaga, salmiana, tecta, ragusae Sisalanae hojas lanceoladas, carnosas, verdes 5 desmettiana, kewensis, neglecta, sisalana, weberi, Umbelliflorae Panícula umbelada 2 shawii, sebastiana sostenida por un tallo suculento Clasificación propuesta por Gentry (1982), * grupos endémicos de México de acuerdo a García- Mendoza (1992) DISTRIBUCIÓN Los agaves son de gran significancia para México, pues éste se considera centro de origen, evolución y diversificación del género. Aproximadamente el 87% (272) de las especies descritas, se encuentran ampliamente adaptadas y distribuidas en los diversos ecosistemas de nuestro territorio; además de la presencia de especies menos evolucionadas y endémicas (López et al.; 2003). La familia Agavaceae se distribuye desde el sur de Canadá, Estados Unidos, México, Centroamérica y norte de Sudamérica, siguiendo la cadena montañosa de los Andes, hasta Bolivia, Paraguay e islas del Caribe (Figura 4) (García-Mendoza y Galván, 1995). A pesar de que estas plantas son nativas de regiones áridas y semiáridas, crecen en distintas elevaciones, desde el nivel del mar hasta más de 2100 m, y en habitats tan variados como bosques, colinas secas, planicies áridas y a la orilla del mar (Irish, 2000). La distribución de los géneros Beschcorneria, Furcraea, Polianthes y Prochnyanthes está restringida a México (Ojeda y Ludlow, 1995). La presencia de algunos agaves en Asia y en el Mediterráneo se considera como dispersión de la especie por la mano del hombre. Por su parte, la distribución de Nolinaceae es aún más restringida. Sus cuatro géneros son endémicos del sur de Norteamérica (Carolina, Georgia, Florida, Colorado, Texas), México y parte de Centroamérica (Guatemala, Belice, Honduras). De aproximadamente 55 especies, en México 10

23 Figura 3. Características morfológicas de miembros de la familia Agavaceae y Nolinaceae. 11

24 Figura 4. Distribución de las familias Agavaceae y Nolinaceae. Modificada de García-Mendoza y Galván

25 se encuentran 49 (89%) (Figura 4) (García-Mendoza y Galván, 1995), siendo la distribución de Beaucarnea restringida en nuestro país (Ojeda y Ludlow, 1995) DESCRIPCIÓN DE LOS GÉNEROS Y CARACTERÍSTICAS DELIMITANTES DE LAS FAMILIAS AGAVACEA Y NOLINACEAE Las familias Agavaceae y Nolinaceae son monocotiledóneas con similitud entre ellas y con otros miembros del orden Asparagales, en el crecimiento de sus hojas en forma de roseta, número de hojas de 20 hasta más de 200, ramilletes florales de seis flores con 6 estambres y 6 tepalos (este último término refiere a la combinación de 3 pétalos y 3 sépalos indistinguibles uno de otro). Cuando las plantas alcanzan su madurez, la inflorescencia emerge de la roseta con ovarios segmentados en tres cámaras. A pesar de dichas similitudes, estas familias difieren en algunos puntos. Análisis citológicos de los agaves han determinado un número cromosomal x = 30 y una haploidía que oscila entre diploíde y hexaploíde (tequilana, 2x = 60) (Ruvalcaba-Ruiz y Rodríguez- Garay, 2002), con 5 cromosomas largos y 25 cortos. En contraste, la familia Nolinaceae tiene 19 cromosomas, todos del mismo tamaño. Los agaves tienen flores perfectas, es decir, la parte masculina y femenina se encuentran en la misma planta; mientras que las de Nolinaceae son dioicas, las flores masculinas y femeninas se encuentran en distintas plantas. Las flores de las Agavaceae son de colores y tamaños variados (al menos de 2.5 cm de largo), mientras que las Nolinaceae son invariablemente de color crema y pequeñas (menores de 2.5 mm) (Figura 3). En las de Agavaceae, algunos géneros como Agave y Furcraea son monocárpicas, es decir, las rosetas mueren después de florecer; mientras que las de Nolinaceae son policárpicas y sus rosetas producen inflorescencia en múltiples años. Con algunas excepciones, los frutos de las Agavaceae son dehiscentes con múltiples semillas planas y negras (con fitomelanos) contenidas en lóculos de tres cavidades que se dispersan en la madurez; mientras que los frutos de las Nolinaceae son indehiscentes con 1 a 6 semillas redondas y cafés (sin fitomelanos) que permanecen en el fruto (García-Mendoza, 1992). A pesar de esto, es importante mencionar que dada las similitudes compartidas entre estos dos géneros, muchas veces Dasylirion y Agave son comparadas e incluso estudiadas juntas. 13

26 AGAVE Los agaves se consideran plantas perennes, pues su ciclo de crecimiento y floración toma más de una estación de crecimiento. Sus hojas generalmente son duras y rígidas (Figura 3), aunque también hay especies de hojas laxas. Muchos agaves, en sus hojas contienen una espina terminal y/o prominentes dientes marginales rectos o curveados, minúsculos o largos y planos o redondeados, siendo todas estas características útiles en la clasificación taxonómica; aunque el color de los dientes y las espinas pueden variar con la edad, medioambiente o condición fisiológica de la planta (Gentry, 1998; Irish, 2000). Sus tallos generalmente son pequeños, muchas veces son sólo una base escondida entre la masa de hojas que de éste emergen, y son raras las especies que forman troncos de tamaño considerable. La inflorescencia emerge del tallo de manera espectacular cuando la planta llega a la madurez, alcanzando 1.8 m en especies pequeñas y hasta 12 m en las más grandes. Ésta tarda en emerger dependiendo de la especie: A. tequilana toma de 8 a 10 años, A. fourcroydes lo hace alrededor de 15 años y en A. deserti sucede cuando la planta alcanza la edad aproximada de 55 años (Nobel, 1987). El largo tiempo en que la planta comienza a florecer favorece que la propagación de la especie sea principalmente asexual a través de la generación de rizomas o hijuelos. Sin embargo, la edad y frecuencia con que los agaves comienzan a producir hijuelos también es variable: a A. tequilana le toma 3 años y A. deserti los produce después de los 13 años (Nobel y Quero, 1986). Por otro lado, algunas especies producen rizomas de manera prolífica, mientras que otros llegan a producir uno o dos rizomas en toda su vida. Las flores establecidas comienzan a abrir desde la base hasta la punta del tallo floral; sus 6 tépalos son duros, sostenidos en dos grupos de tres, en algunos casos con una disposición de ramillete o fusionados con el tejido ovárico. Las flores de las formas paniculadas son más resistentes y duraderas que las formas espigadas, influyendo esto en el tipo de animales que las polinizan, siendo murciélagos y pájaros en el primer caso y pequeños insectos en el segundo (Figura 3). Variedades distintas de agave tienen diferentes propiedades y características; algunas por ejemplo, son mejores productoras de savia, otras son mejores en la obtención de fibras y otras tantas se desarrollan mejor en suelos con ciertas características. El orígen para la diversidad botánica de estas especies se sugiere como resultado de una selección prehistórica humana con el fin de incrementar cualidades específicas, aumentando así el sistema productivo del agave diversificado y especializado (Parsons y Darling, 2000). 14

27 Agave tequilana Weber var. azul A. tequilana es una planta suculenta de tallo grueso y corto que alcanza de 30 a 50 cm en la madurez. El órgano floral mide de 5 a 6 m y es densamente ramificado con 20 a 25 umbelas largas con flores verdes de 68 a 75 mm de largo, sostenidas sobre pequeños pedicelos bracteolados. Las pencas se extienden radialmente con una longitud de 90 a 120 cm de largo por 8 a 12 cm de ancho, son lanceoladas, acuminadas, fibrosas, cóncavas, más anchas en medio, volviéndose angostas y más gruesas hacia la base; presentan un color azul verdoso que le da nombre a su variedad, con un margen regularmente dentado y espinas aplanadas de 1 a 2 cm de largo. A. tequilana alcanza su madurez fisiológica entre los 8 y 12 años. Para fines comerciales, la inflorescencia se corta cuando comienza a emerger; de esta manera los carbohidratos destinados a la emergencia floral son ahora acumulados en el tallo Agave angustifolia Haworth El tamaño y forma de A. angustifolia es altamente variable, su roseta puede ser de 1 a 1.5 m de alto y de 2 a 2.4 m de ancho; la formas varigatas son mucho más pequeñas. Las plantas producen numerosos hijuelos, por lo que raramente son plantas solitarias. Sus hojas lanceoladas son numerosas y rígidas, de 2.5 a 10 cm de ancho y de 0.6 a 1.2 m de largo, planas en la superficie, convexas hacia la punta, angostas y gruesas hacia la base. El color de sus pencas varía de verde a verde grisáceo, con pequeños dientes curveados y espaciados cada 1.3 a 3.8 cm y una espina terminal corta, generalmente color café o de color granate o negro. La inflorescencia paniculada de A. angustifolia es de 3 a 5 m de largo con 10 a 20 ramificaciones con flores verdes a amarillas. Esta es la especie más ampliamente distribuida en Norteamérica. Generalmente se le encuentra cerca del litoral, sabana tropical, bosques de espinas y bosques tropicales caducos; se distribuye en elevaciones que van desde el nivel del mar (desierto sonorense con precipitación media anual de 250 mm) hasta los 1500 msnm o más (zona montañosa de bosque de encino de Uruapan, Mich. con precipitación anual de 1680 mm) (Gentry, 1998). La especie tolera cualquier condición y tipo de suelo (Irish, 2000), aunque durante su establecimiento la plántula es sensible a altas temperaturas del suelo, por lo que generalmente requiere una planta nodriza como arbustos o árboles para crecer bajo su sombra. 15

28 Agave potatorum Zuccarini A. potatorum, tobala o papalometl es una especie pequeña y solitaria. Existen aproximadamente 33 variedades de acuerdo a las características de sus hojas, las cuales se encuentran entre 30 y 80, dispuestas simétricamente alrededor de un tallo pequeño para formar una roseta abierta. Las hojas varían en forma y color, desde ovaladas, cuadriculadas o cortas lanceoladas, de 9 a 18 cm de ancho y de 25 a 40 cm de largo y de color verde grisáceo hasta blanca. El margen de las hojas presentan protuberancias (margen mamilado), así como dientes de 0.6 a 1.3 cm de largo y espaciados por 1.3 a 2.5 cm, con una espina terminal afilada de 2.5 a 4.4 cm de largo y de forma sinuosa o torcida. La inflorescencia de A. potatorum puede ser un racimo o una panícula de 3 a 6 m de largo, con flores verde-amarillo y matices rojos; su reproducción es por semillas. Esta planta se distribuye principalmente en tierras altas y semiáridas de Oaxaca y Puebla a elevaciones entre 1350 y 2250 msnm (Irish, 2000) Agave cantala A. cantala presenta rosetas verdes de 2 a 2.5 m de largo; hojas de 1.5 a 2 m, acuminadas, redondeadas hacia la base, de color verde claro u oscuro, orilla lisa en la punta, rugosa en la base, dientes cafés pequeños de 3 a 4 mm de largo con frecuencia cada 2 o 3 cm y espina terminal pequeña de 5 a 15 mm de largo. La panícula es de 6 a 8 m de largo, bulbífera con alrededor de 20 umbelas difusas en la parte superior, flores verdosas con tintes morados o rojizos de 70 a 85 mm de largo; ovario fusiforme de 32 a 42 mm de largo (Gentry, 1998) Agave fourcroydes A. fourcroydes o henequén desarrolla un tronco de 1 a 1.7 m de largo. Sus hojas largas, delgadas, angostas y lanceoladas son de color verde grisáceo, de 8 a 13 cm de ancho y de 1.2 a 1.8 m de largo; con espinas oscuras espaciadas y una espina terminal redondeada de 2 a 2.5 cm de largo. El ciclo de esta especie toma de 20 a 25 años y al final del mismo, se forma la inflorescencia panículada de 5 a 6 m de largo con 10 a 18 ramificaciones. En sus flores verdes o amarillas, se han observado malformaciones genéticas en sus gametos, adjudicadas a su naturaleza pentaploide (5x = 30), por lo que los granos de polen son estériles o de baja fertilidad y su propagación es principalmente por rizomas o bulbillos. Sin embargo, en el Centro de Investigación Científica de Yucatán (CICY) se determinó que el potencial germinativo puede ser de hasta el 16

29 93%, abriendo con esto una alternativa para favorecer la variabilidad genética de esta población (Barredo-Pool et al., 2004). La distribución de A. fourcroydes es común en Yucatán, Veracruz y Tamaulipas. Es una especie susceptible al frío, una temperatura de -2 C ocasiona serios daños a las hojas (Irish, 2000) DASYLIRION Dasylirion, de los vocablos griegos dasys, grueso y lily, lirio es la palabra propuesta por Zuccarini (1838) para describir la forma de penacho de uno de los géneros predominantes del desierto Chihuahuense (Figura 3). Cuando las plantas de Dasylirion son pequeñas, su crecimiento en roseta es similar a los agaves; sin embargo cuando las plantas maduran, el tallo se vuelve prominente, tomando forma de tronco que raramente alcanza 1 m de altura, siendo D. quadrangulatum una excepción notable al presentar un tronco de hasta 5 m al envejecer. Las hojas de Dasylirion son largas, lineales, flexibles y su color varía entre verde amarillento, verde oscuro o azul-grisáceo. Su margen es rayado con largos dientes pequeños, ganchudos, apuntando hacia la base y de color amarillo a café. Entre los espacios de estos dientes se encuentran otros diminutos, formando así un margen serrado. Una de las especies más abundantes es D. wheeleri conocida también como sotol o cuchara del desierto, dado que sus hojas largas, hasta 1 m de longitud, delgadas y fibrosas se ensanchan hacia la base (de 0.9 a 3 cm) dando una forma de cuchara. A diferencia de los agaves, las hojas de Dasylirion son suaves y deshiladas formando un follaje azul verdoso que se torna oscuro al madurar. Las flores masculinas de Dasylirion presentan estambres amarillos protuberantes, mientras que las femeninas son blanco-verdoso, seguidas por semillas en el interior de cápsulas aladas. La madurez de la planta, la disponibilidad de agua y probablemente la longitud del día, son factores que inducen la formación del tallo floral, que llega a tener dimensiones entre 1.8 y 5.2 m. Dasylirion es una planta bien adaptada a condiciones áridas, temperaturas extremas y también a cualquier tipo de suelo. No hay evidencias científicas que indiquen el tiempo de vida de Dasylirion pero hay quienes sugieren que 150 años es una edad posible. 17