Microbiología Ambiental. 5to Semestre 2016, LGA

Transcripción

1 Microbiología Ambiental 5to Semestre 2016, LGA 1

2 Clase 3: o Estructura y replicación del ADN. o Plásmidos bacterianos: concepto y significado biológico. o Mutaciones. Tipos de mutaciones. Agentes mutágenos. o Recombinación genética: concepto, conjugación, transformación y transducción. o Relevancia sanitaria & ambiental 2

3 Estructura y replicación del ADN Genoma: conjunto de elementos genéticos. En procariotas los elementos genéticos son: ü Cromosomas ü Elementos no cromosómicos: plásmidos, virus y Transposones El material genético de las bacterias se encuentra en el citoplasma: nucleoide, cuerpo nuclear o región nuclear. 3

4 Estructura y replicación del ADN Cromosoma bacteriano: doble cadena de ADN (~1 mm de longitud), circular y cerrada de manera covalente. El ADN bacteriano no está rodeado por una membrana, tiende a aglomerarse como una estructura definida: el nucleoide La célula bacteriana es haploide, existe una copia sencilla de cada gen. 4

5 Comparación tamaños genomas 5

6 Tamaño depende de estilo de vida Giovannoni et al

7 Estructura y replicación del ADN Los procesos genéticos requieren tres tipos de polímeros: o Acido Desoxirribonucleico (ADN). o Acido Ribonucleico (ARN). o Proteínas. 7

8 Componentes de los Ácidos Nucleicos Las cadenas poliméricas de los ácidos nucleicos están conformadas por monómeros, denominado NUCLEÓTIDOS constituidos por: o Un azúcar pentosa (ribosa o desoxirribosa, según el ácido nucleico) o Un grupo fosfato o Una base nitrogenada (purina o pirimidina). 8

9 Componentes de los Ácidos Nucleicos Las purinas de una cadena forman puentes de hidrógeno con las pirimidinas. El par A-T con 2 uniones El par G-C con tres uniones. Cada una de las cuatro bases esta unida a una fosfo-2 -desoxirribosa para formar un nucleótido. El contenido de pares GC es herramienta taxonómica 9

10 ADN La longitud de una molécula de ADN se expresa en miles de pares de bases o en kilobases (kb). Por ejemplo: el cromosoma de una bacteria, E. coli, tiene 4,500,000 pares de bases o 4500 kb. 10

11 ARN Existen 3 diferencias entre la química del ADN y la del ARN : 1. Las macromoléculas del ARN contienen el azúcar ribosa en lugar de desoxirribosa. 2. El ARN tiene la base uracilo en lugar de timina. 3. El ARN no es una molécula de tira doble, sin embargo,se puede doblar sobre si misma en regiones complementarias. 11

12 ARN Las bacterias contienen 3 tipos de RNA: 1. ARNm: (mensajero), su función es copiar el código genético del gen (DNA cromosómico) y llevar este mensaje al sitio de síntesis de proteínas (Ribosomas). 2. ARNt (transferencia, "adaptadoras ),traducción del mensaje de RNA en una secuencia específica de aminoácidos. 3. ARN (ribosomal) síntesis de proteínas. 12

13 ARN Ribosomal 21 Proteínas 16S rrna Ribosoma 5S rrna 34 Proteínas 23S rrna Escherichia coli 16S rrna 13

14 Enzimas 1. Topoisomerasa II: promueve el superenrollamiento (ADN girasa) 2. Toposiomerasa I: controla el desenrrollamiento. 3. ARN polimerasa: hace que las dos tiras de ADN se desenrollen de modo que se pueda transcribir la información. 4. ADN ligasa: une los fragmentos sintetizados. 5. Primasa: inicia la síntesis de un fragmento roto. 6. Endonucleasas de restricción: causan rupturas en la doble cadena en secuencias específicas que presenten simetría binaria 14

15 Elementos no cromosómicos: Plásmidos 15

16 Plásmidos ADN bicatenario (circular) Tamaño de Kpb Pueden haber varias copias en la misma célula Pueden haber varios plásmidos diferentes (compatibles) en la misma célula Los plásmidos son generalmente elementos que se replican independientemente del cromosoma del hospedador. No tienen formas extracelulares en la naturaleza 16

17 Plásmidos Confieren ventajas al hospedador en determinadas condiciones: ü Resistencia antibióticos ü enzimas para degradación de compuestos orgánicos ü rutas metabólicas especiales Se pueden transferir mediante contacto célula-célula. 17

18 Plásmido R (resistencia) Confieren resistencia a inhibidores del crecimiento: Antibióticos Metales pesados Otras funciones codificadas por plásmidos: Factores de virulencia Degradación de compuestos recalcitrantes (ej tolueno) Producción de bacteriocinas Fijación de Nitrógeno 18

19 Plásmidos conjugativos Gobiernan su propia transferencia de una célula a otra por contacto. La transmisibilidad por conjugación esta controlada por un conjunto de genes (región tra) dentro del plásmido. Los no-conjugativos no pueden iniciar la conjugación, sólo se transfieren con la asistencia de plásmidos conjugativos 19

20 Plásmidos de diseño las técnicas de ingeniería genética han hecho posible la construcción en el laboratorio de un número ilimitado de nuevos plásmidos artificiales. Incorporación de genes de una amplia variedad de orígenes Aplicación en biología molecular, terapias génicas, biotecnología 20

21 Elementos no cromosómicos: Virus 21

22 Virus Parásitos obligados Pequeños (20-200nm) Ciclo de vida en dos fases: Fase extracelular no activa (virión) Fase intracelular (replicación) modifican el funcionamiento celular (hospedador) para su propia subsistencia 22

23 Ciclos lítico y lisogénico 23

24 Elementos no cromosómicos: Elementos genéticos transponibles 24

25 Elementos genéticos transponibles Pueden moverse de un lugar a otro del DNA Se replican con la molécula de ADN en la cual están insertos En procariotas: 1. Secuencias de inserción (IS) pb gen tnp codifica la transposasa secuencias repetidas inversas en extremos 2. Transposones: IS (dos) + otros genes (ej. resistencia a antibióticos) 3. Algunos virus: bacteriófago Mu 25

26 Cómo se genera la variación genética? 26

27 Replicación del ADN o Proceso por el cual el ADN que contiene el código genético se duplica. o El producto son dos moléculas, es decir las dos cadenas se convierten en cuatro. o La división es semi-conservadora, las dos dobles hélices de la progenie constan de una molécula de la progenie y otra de la madre, es decir una nueva y la otra vieja Errores durante la replicación: introducción de variabilidad genética 27

28 Replicación del ADN 28

29 Replicación del ADN 29

30 Variaciones en la información genética La variación en la constitución genética se puede dar por dos procesos: 1. La mutación: origina un cambio heredable en la secuencia de bases del ADN bacteriano. 2. La recombinación genética: involucra la transferencia de ADN entre una bacteria donadora y otra receptora y la integración del material transferido al genoma de la bacteria receptora. 30

31 Mutaciones Cambio heredable en la secuencia de bases del ácido nucleico que constituye el genoma de un organismo. Los errores en la replicación introducen mutaciones a una velocidad baja Corrección de lectura: ADN polimerasa ejerce también una actividad 3-5 exonucleasa que consiste en remover nucleótidos mal insertados y reemplazarlo por el correcto. Existen proteínas endonucleolíticas que suprimen nt insertados erróneamente mucho después que la polimerasa ha pasado. Los sistemas de reparación (especialmente el SOS) también tienen errores ocasionando mutaciones 31

32 Mutaciones Un mutante diferirá de su progenitor en su genotipo y fenotipo (no siempre). ü Genotipo: constitución génica precisa de un organismo. (conjunto de genes) ü Fenotipo: propiedades visibles de un organismo ü Cepa salvaje o silvestre: cepa aislada de la naturaleza Pueden ocurrir cambios perjudiciales, neutros o beneficiosos. 32

33 Tipos de mutaciones o Selectivas: confiere al mutante una ventaja, ej. Resistencia a fármacos: el mutante es capaz de crecer en presencia de un antibiótico que inhibe a la cepa parental. o No selectivas: No confieren ventajas o desventajas. o Nutricionales: cambian el requerimiento de factores de crecimiento (cepas auxótrofas y protótrofas). 33

34 Tipos de mutaciones Puntuales: -Sustitución de una pirimidina por otra (transición) -Sustitución de una pirimidina por una purina (transversión) -Inserciones o deleciones de uno o unos pocos nucleótidos que ocasionan corrimiento del marco de lectura De muchos pares de bases: -Inserciones o deleciones de grandes segmentos de ADN 34

35 Efectos de las mutaciones UAC Codón de tirosina CAC Codón de histidina UAG Codón de terminación UAU Codón de tirosina PROTEÍNA DEFECTUOSA MUTACIÓN DE CONTRASENTIDO PROTEÍNA INCOMPLETA MUTACIÓN SIN SENTIDO PROTEÍNA NORMAL MUTACIÓN SILENCIOSA 35

36 Corrimiento marco de lectura THE FAT CAT SAT 36

37 Corrimiento marco de lectura THE FAT CAT SAT HEF ATC ATS AT 37

38 Recombinación genética o Proceso mediante el cual los elementos genéticos de dos orígenes diferentes se reúnen en una sola unidad. o Se transfieren genes completos, grupos de genes o cromosomas completos. o En los procariotas se da por la inserción en una célula receptora de un fragmento de ADN genéticamente diferente derivado de una célula donadora 38

39 Fuentes de ADN para ü Transformación recombinación ü Transducción ü Conjugación 39

40 Transformación o ADN libre se incorpora a la célula receptora y provoca un cambio genético. o Una célula capaz de adquirir una molécula de ADN y transformarse se dice que es competente (propiedad heredada por el organismo). o Intervienen proteínas especiales en el transporte e incorporación del DNA. o Durante la replicación de este ADN híbrido, se forma una molécula parental y otra recombinante. o El ADN viral también puede participar en la transformación mediante el proceso denominado transfección. 40

41 Competencia inducida Experimentos con E. coli han encontrado métodos de inducción artificial : o Tratamiento con cloruro de calcio y shock térmico. o Electroporación: las células se exponen a campos eléctricos pulsados para abrir pequeños poros en su membrana. 41

42 a) Fijación del ADN por una proteína de unión al ADN ligada a la membrana (autolisina y nucleasas). b) Incorporacion del ADN: Se fija reversiblemente, luego se vuelve irreversible.pasa una de las dos cadenas mientras la actividad nucleasa degrada la otra. c) Integracion del DNA: la cadena sencilla se une a proteína de unión y tiene lugar la recombinación con regiones homólogas del cromosoma mediada por la proteína RecA d) Célula transformada 42

43 Experimento de Griffith 43

44 Transducción Proceso por el cual el ADN es transferido de una célula a otra mediante la participación de un virus. o Generalizada: ADN del huésped, de cualquier parte del genoma, pasa a formar parte del ADN de una partícula madura del virus en lugar del genoma de éste. o Especializada: ocurre solo en algunos virus atemperados, el ADN de una región específica del cromosoma bacteriano se integra directamente en el genoma del virus, generalmente reemplazando algunos de los genes del virus. 44

45 Transducción generalizada 45

46 Transducción especializada Ej. Transducción de los genes de la galactosa por el fago atemperado lambda de E. coli 46

47 Conjugación (apareamiento) Proceso de transferencia genética que requiere contacto célula a célula. o Mecanismo codificado por un plásmido conjugativo. o Célula donadora, que contiene el plásmido conjugativo y y una célula receptora que carece de él. 47

48 48

49 Relevancia sanitaria & ambiental o Transferencia de propiedades: Ej.: resistencia a antibióticos, degradación de xenobióticos o Bacterias como indicadores de mutagenicidad (test de Ames) 49

50 Relevancia sanitaria & ambiental o resistencia a antibióticos 50

51 Blancos de los antibióticos (1) Síntesis de la pared celular penicilinas cefalosporinas vancomycina (β-lactámicos) (péptido no-ribosomal) (2) Síntesis Proteica erytromycina (macrolide polyketides) tetracyclina (aromatic polyketides) streptomycina, kanamycina (aminoglycosides) (3) Replicación del ADN quinolonas (Cipro) 51

52 Blancos de los antibióticos Explotan diferencias celulares procariotas/ eucariotas (1) Síntesis de la pared celular Bloquean síntesis de peptidoglicano (2) Síntesis Proteica Se dirigen contra el ARN ribosomal 23S y proteínas asociadas (3) Replicación del AND Inhiben la girasa 52

53 Resistencia a antibióticos Ocurre cuando un antibiótico pierde la habilidad de controlar el crecimiento bacteriano. Las bacterias resistentes siguen creciendo en presencia de niveles terapéuticos del antibiótico 53

54 Bombas de resistencia MultiDroga Proteínas de membrana que bombean cualquier molécula lipofílica fuera de la célula Muy poderoso, expulsa muchas drogas distintas 54

55 Mecanismos de transferencia 1. Transducción horizontal 2. Transformación ü Neisseria gonorrhoeae Penicilinaresistente 3. Conjugación ü En 1968, 12,500 personas murieron en Guatemala en una epidemia de diarrea por Shigella dysenteriae 55

56 Resistencia a Antibióticos Droga Introducción Aparición de resistencia Penicilina Estreptomycina Tetracyclina Erythromycina Vancomycina Methicilina Ampicilina Cephalosporinas 1964 fines de los 60 s 56

57 Estrategias para demorar la expansión de resistencia: ü No usar antibióticos para tratar infecciones virales. ü Evitar dosis bajas de antibióticos por períodos largos de tiempo. ü Culminar el tratamiento prescripto al tratar una infección bacteriana. ü Reducir/eliminar el uso preventivo de antibióticos en ganado y cultivos. 57

58 Relevancia sanitaria & ambiental o Bacterias como indicadores de mutagenicidad (test de Ames) 58

59 Ensayos de mutagenicidad y genotoxicidad Genotoxicidad: toxicidad que afecta al material genético y que manifiesta una expresión retardada en el tiempo o sustancias genotóxicas: ü mutágenos (capaces de incrementar la tasa de mutación) ü carcinógenos (capaces de incrementar la tasa de aparición de un tumor). o pueden alcanzar el medio ambiente, ej. el acuático, y producir efectos directos o indirectos sobre el hombre, animales, incluso a bajas concentraciones 59

60 Ensayos de mutagenicidad y genotoxicidad -ensayos para determinar el potencial genotóxico de una sustancia química o muestra ambiental: intercambio de cromátidas hermanas en peces o el ensayo de determinación de micronúcleos en los linfocitos periféricos de larvas de anfibios Células de cebolla y roedores han sido empleado en un ensayo de determinación de la genotoxicidad en el que se investigan parámetros citológicos como el índice mitótico, aberraciones cromosómicas, aneuploidía y c- mitosis. Caros, laboriosos, llevan mucho tiempo, como alternativa se han desarrollado ensayos que utilizan microorganismos 60

61 Test de Ames experimento control Agente mutágeno Extracto de hígado Cultivo Salmonella his - Medio sin histidina Incubación Colonias de revertientes Salmonella his+ No hay crecimiento 61

62 Test de Ames experimento Agente mutágeno Extracto de hígado Cultivo Salmonella his - Medio sin histidina Incubación Colonias de revertientes Salmonella his+ Crecimiento dosis/potencia dependiente 62

63 Próxima clase Arrancamos con metabolismo! Repasar óxido-reducción 63

64 Recombinación -entre secuencias con alta homología -mediada por RecA -fases: corte de una hebra apareamiento de hebras intercambio entre las hebras resolución de las hebras 64