TEMA 11.- CINÉTICA ENZIMÁTICA

Transcripción

1 TEMA 11.- CINÉTICA ENZIMÁTICA Introducción: Cinética enzimática. Ecuación de Michaelis-Menten. Ecuación de Lineweaver-Burk. Reacciones con múltiples substratos. Inhibición enzimática: - Reversible Competitiva. No competitiva. Acompetitiva. - Irreversible. Ejemplos de inhibidores irreversibles

2 Introducción. Cinética enzimática La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Perfil cinético de un enzima micaeliana Perfil cinético de un enzima alostérico

3 Modelo Cinético de Michaelis-Menten Las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: Primera etapa, se forma el complejo enzima-sustrato. Segunda etapa, el complejo enzima-sustrato se transforma en el producto, liberando el enzima. V 1 = k 1 [E] [S] V 2 = k 2 [ES] V 3 = k 3 [ES] En equilibrio la V de formación de ES es igual a la velocidad de descomposición. V 1 = V 2 + V 3 k 1 [S] [E] = (k 2 + k 3 )[ES] [E] = [ET] - [ES] donde la expresión (k 2 + k 3 )/k 1 se ha sustituído por K M, o constante de Michaelis-Menten

4 Modelo Cinético de Michaelis-Menten La velocidad de reacción = la velocidad de formación del producto: v = v 3 = k 3 [ES] = La velocidad máxima (Vmax) se obtiene cuando el enzima está saturada por el S. Vmax = k 3 [E T ] Si introducimos el parámetro Vmax en la ecuación general de la velocidad obtenemos la expresión más conocida de la ecuación de Michaelis-Menten:

5 Modelo Cinético de Michaelis-Menten La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v frente a [S]) es una hipérbola K M es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. En efecto, si K M = [S], la ecuación de Michaelis-Menten se reduce a: v = V max /2. El valor de K M da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: A menor K M, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor K M, menor afinidad.

6 Representación de Lineweaver-Burk Para determinar gráficamente los valores de K M y Vmax es más sencillo utilizar la representación doble recíproca (1/v frente a 1/[S]), ya que es una línea recta. Esta representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk 1 v 1 K M /Vmax 1 v = V max [S] v = Km + [S] [ Km ] V max [S] V max V max y= m. x + b - 1 Km 1 [S] pendiente es K M /Vmax abscisa en el origen es -1/K M ordenada en el origen es 1/Vmax A partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores de K M y Vmax de un enzima para diversos sustratos.

7 Reacciones con múltiples substratos a) Reacción enzimática con formación de un complejo ternario (ES 1 S 2 ) a.1. Unión aleatoria de los S a.2. Unión ordenada de los S b) Reacción enzimática en la que no se forma de un complejo ternario Mecanismo ping pong

8 Inhibidor: Efector que se une al enzima y hace disminuir su actividad, mediante interacciones con el centro activo u otros centros específicos. Se excluyen todos aquellos agentes que inactivan a la enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática. Dos tipos de inhibidores: Inhibición Enzimática * Inhibidores reversibles: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato, o con ambos. - COMPETITIVOS: El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijación del sustrato. - NO COMPETITIVOS: El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el sustrato. No impide la fijación del sustrato a la enzima, pero sí la acción catalítica. - ACOMPETITIVOS: El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-sustrato una vez formado, impidiendo la acción catalítica * Inhibidores irreversibles: modifican químicamente a la enzima mediante uniones covalentes.

9 Inhibición reversible Inhibición competitiva S I E ES E + P EI Se define una constante de equilibrio de disociación del inhibidor K i = [E] [I] [EI] Características: -Las fijaciones de sustrato e inhibidor son mutuamente excluyentes. - A muy altas concentraciones de sustrato desaparece la inhibición. - Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo estructural del sustrato. - El inhibidor es tan específico como el sustrato.

10 Inhibición reversible Inhibición competitiva Representación directa Inhibición competitiva v = V max [S] [ ] Km 1+[I] + [S] Ki v Sin Inhibidor Con Inhibidor Km = Km (1+[I]/Ki) s

11 Inhibición competitiva - Representación recíproca doble 1/v /V max -1/K m /s /(K m (1 + i/k i ))

12 Ejemplo de inhibición competitiva CH 2 FAD FADH 2 CH CH 2 Succinato SDH Succinato deshidrogenasa CH Fumarato Inhibidores competitivos CH 2 Malonato C O CH 2 Oxalacetato

13 Inhibición reversible Inhibición no competitiva S E ES I I S E + P EI ESI Características: - El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre (E) y al complejo enzima-sustrato (ES) - Ni el complejo EI ni el complejo ESI son productivos

14 Inhibición reversible Inhibición no competitiva Vmax < Vmax V max = V max /(1+[I]/K i ) V = Vmax. [S] Km. (1+[I]/Ki) + [S]. (1+[I]/Ki) Vmax = Vmax/(1+[I]/Ki)

15 Inhibición reversible Inhibición acompetitiva o mixta - El I sólo se une al complejo ES y en un sitio distinto al que se fija el S en el centro activo - Baja la Km y Vmax, pero el cociente Km/Vmax no se altera. -Ocurre en reacciones multisustratos El lugar de unión del I se crea tras la unión del S al E

16 Inhibición reversible Inhibición acompetitiva o mixta Inhibición acompetitiva

17 Inhibición Irreversible - Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima, modificándola covalentemente E + I E - Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos. - Una clase especial de inhibidores irreversibles son los Inhibidores suicidas: Son poco reactivos hasta que se unen al centro activo del enzima, donde se transforman en un compuesto muy reactivo, inactivando irreversiblemente al enzima. Algunos tipos de inhibidores irreversibles: 1. Reactivos de grupos -SH 2. Organofosforados 3. Ligandos de metales 4. Metales pesados

18 Ejemplos de inhibidores irreversibles Compuestos organofosforados Ser Diisopropil fluorofosfato (DFP) CH CH 2 OH H 3 C CH 3 CH F P O CH H 3 C CH 3 Ser H 3 C CH 3 CH CH CH 2 O P O CH H 3 C CH 3 Malation - Actúan sobre enzimas serínicas (serin proteasas, acetil colinesterasa...), uniéndose covalentemente a través del grupo fosfato. Ejemplos: DFP, Insecticidas (Paration, Malation) Gases de guerra (Sarín), gas mostaza.

19 Ejemplos de inhibidores irreversibles Ión cianuro, CN - : Se fija con gran afinidad a la sexta posición de coordinación del Fe hemínico del complejo citocromo oxidasa. Penicilinas. Inhiben enzimas serínicas que participan en la formación de la pared bacteriana.

20 Inhibidor suicida (Inhibidores activados enzimáticamente) - Se trata de moléculas que se unen al centro activo de manera específica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos - Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la molécula en una especie química muy reactiva que modifica covalentemente a la enzima, inactivándola - Tienen por tanto la especificidad del inhibidor competitivo y la potencia de los inhibidores irreversibles Modo de acción de los inhibidores suicidas E + I EI EI* E + I* 1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el sustrato o un inhibidor competitivo convencional. 2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie altamente reactiva I*. 3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.

21 Ejemplo de inhibidores suicidas Sistema de la β-lactamasa bacteriana La utilización masiva de antibióticos β-lactámicos (penicilinas,derivados semisintéticos y cefalosporinas) ha conducido a la aparición de resistencias a los mismos. Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son por producir una enzima, la β-lactamasa, que inactiva a los antibióticos β-lactámicos. Penicilina (activa) S R CO NH CH 3 N CH 3 O β-lactamasa S R CO NH CH 3 O C HN CH 3 O - Ác.peniciloico (inactivo) Con frecuencia los preparados de penicilinas se formulan añadiendo un inhibidor suicida de la β-lactamasa, el ácido clavulánico O N O C CH 2 OH H Ác.clavulánico CH Ser CH 2 O C O β-lactamasa HN O C O C O - CH 2 OH H HN O C CH 2 OH Esta molécula reacciona con la serina activa de la β-lactamasa, produciendo su inactivación H

22 Resumen de los parámetros cinéticos de las reacciones enzimáticas: efecto de los distintos tipos de inhibición. Tipo de inhibición Ecuación de velocidad Km Vmáx Sin inhibidor Vmáx. [S] V = Km + [S] Km Vmáx Inhibición competitiva Vmáx. [S] V = Km. (1+[I]/Ki) + [S] Km (1+[I]/Ki) Vmáx Inhibición no competitiva Vmáx. [S] V = Km.(1+[I]/Ki)+[S].(1+[I]/Ki) Km Vmáx/(1+[I]/Ki) Inhibición acompetitiva o mixta V = Vmáx. [S] Km +[S].(1+[I]/Ki) Km/(1+[I]/Ki) Vmáx/(1+[I]/Ki)