Catálisis enzimática. Tema 8 (cont)

Transcripción

1 Tema 8 (cont) Catálisis enzimática 1 Para entender las enzimas necesitamos dos propiedades termodinámicas de la reacción 1. Diferencia de E libre (ΔG) entre productos y reactantes. Se relaciona con la constante de equilibrio (K). ΔG (+) r.endergónica ΔG = 0 r. en equilibrio ΔG= ΔG 0 + RT ln K eq ΔG (-) r. exergónica E libre estándar No influye sobre la v de reacción 2. Energía que se requiere para iniciar la conversión de reactantes en productos= E libre de activación (ΔG ) Determina la v de reacción Las enzimas influyen en ésta 2 Las reacciones metabólicas se rigen por las leyes de la termodinámica 1º.- Principio de conservación de la energía 2º.- Aumento natural del desorden Energía libre de Gibbs (G): Cantidad de energía capaz de realizar trabajo durante una reacción a Tª y presión constantes, condiciones físicas para la vida Entalpía (H): contenido calórico del sistema Entropía (S): aleatoriedad o desorden del sistema 3 1

2 H > 0 Reacción endotérmica (absorbe calor) H < 0 Reacción exotérmica (libera calor) S > 0 Aumenta entropía en el sistema S < 0 Disminuye entropía en el sistema ΔG = ΔH - TΔS Entalpía (H): contenido calórico del sistema Entropía (S): aleatoriedad o desorden del sistema 4 La única energía que pueden utilizar las células es la energía libre, porque es la única capaz de realizar trabajo durante una reacción a Tª y presión constantes : Energía libre de Gibbs (G) Proporciona información sobre: - La dirección de la reacción química - Composición en el equilibrio - La cantidad de trabajo desarrollado por la reacción 5 Variación de energía libre (ΔG) Predice si una reacción es posible energéticamente o no ΔG = 0 Proceso en equilibrio ΔG > 0 Reacción endergónica, consume energía ΔG < 0 Reacción exergónica, genera energía (espontánea) Relación entre el G y la K de equilibrio de una reacción: 6 2

3 En condiciones estándar 25º C, 1 atm presión, [R] y [P] = 1 M la variación de G se denomina: ΔG o En condiciones fisiológicas: ph = 7, ΔG o ΔG o es un parámetro que expresa la termodinámica de una reacción, al igual que la constante de equilibrio y es característica de cada reacción bioquímica K eq < 1 ΔG o (+) endergónica K eq = 1 ΔG o (0) equilibrio K eq > 1 ΔG o (-) espontanea 7 ΔG o = variación de E libre en condiciones estándar (25º C, 1 atm, [R] y [P] = 1 M). Valor fijo para cada reacción ΔG = variación de E libre real. Es variable, depende de la [R] y [P] y de la Tª Si la reacción está en el equilibrio, la variación de energía libre es nula ΔG = 0 8 La velocidad de la reacción depende de la Energía libre de activación (ΔG ) que no está relacionada con ΔG La diferencia en la E libre entre el estado de transición X y el S se denomina Energia de activación (ΔG ) S X P indica estado de transición. Con >E libre que S ó P ΔG = G X -G S Aceleran las reacciones porque ΔG 9 3

4 Energía de activación: La conversión de S en P es termodinámicamente favorable (ya que P tienen menor energía que S) pero S no pasa a P si no adquiere la energía suficiente para superar la barrera de energía. Esta energía necesaria se denomina Energía de activación ó energía libre de Gibbs (ΔG ) Ej: Oxidación de glucosa a CO 2 y H 2 O S ΔG P P 10 Reacción química ordinaria Para que se verifique una reacción es necesario comunicar una energía denominada Energía de Activación. Incluso cuando ΔG < 0 El compuesto S con un determinado nivel energético debe alcanzar un estado de transición, o nivel energético mas alto para ser transformado en producto P. P se encuentra en un nivel energético menor El estado de transición representa una barrera energética que hay que salvar. 11 ΔG S P = Energía de activación para que S alcance el estado de transición ΔG P S ΔG 0+ = Energía de activación para que P alcance el estado de transición = Variación de E libre estándar global para ir de S a P ΔG P S- ΔG = ΔG 0+ S P Cuanto mayor sea la Energía de activación para el estado de transición, S tendrá mas dificultades para transformarse en P. S es muy estable y tardará mas tiempo en alcanzar el estado de transición reacción es mas lenta y tarda mas. 12 4

5 Cómo actúa un enzima? Es un catalizador Disminuyendo la Energía de activación No modifica el equilibrio de la reacción Cataliza el paso de S a P y de P a S Acelera la interconversión de S a P. El equilibrio se alcanza de forma mas rápida. Incrementa la velocidad de reacción <<ΔG ; ΔG 0+ no se modifica E de activación r. no catalizada Formación y desintegración de especies químicas transitorias Paso limitante de velocidad E de activación r. catalizada T de reacción 15 5

6 Etapas de la reacción catalizada enzimaticamente 1. E reconoce a S. Comienza la formación de ES* 2. Complejo ES formado 3. Transformación del complejo ES en un complejo intermedio de transición EI. Se favorece la acción catalítica del enzima 4. Comienza la formación del complejo EP 5. Empieza la disociación de P en EP* 6. Disociación total de P y liberación de E E + P S + E ES* ES EI EP EP* E + P 16 Paso limitante de velocidad EI ES* EP* EI, es un complejo intermedio de transición 17 Enzimas Las energías de activación son barreras energéticas que las reacciones químicas deben salvar. Cuanto mas elevadas sean mas estables son las sustancias reaccionantes Las Enzimas se necesitan para disminuir la energía de activación de forma selectiva en las reacciones que son necesarias para la supervivencia celular Permitiendo que la reacción tenga lugar en una escala útil para las células 18 6

7 Como se puede explicar la acción de un enzima? Las enzimas interaccionan de manera transitoria con el sustrato Esas interacciones suponen la activación de ese sustrato El máximo de las interacciones tienen lugar cuando se alcanza el estado intermedio de transición (EI) 19 Energía de fijación Energía desprendida durante la formación del complejo ES y sobre todo del EI Se forman interacciones débiles progresivas ( puentes de H; fuerzas Van der Waals; interacciones hidrofóbicas) Energía de fijación ΔG t de reacción 20 El poder catalítico de una reacción se fundamenta a) Energía de fijación ( interacciones ES) b) Propio poder catalítico del E c) Estructura del S en EI, es decir en el centro activo, debe ser complementaria a la del E también en ese centro activo 21 7

8 Ejplo : Barra metálica y encaje inducido Energía de fijación Es la principal fuerza motriz dominante de la catalisis Barreras energéticas (físicas y termodinámicas)compensadas por la Energia de fijación del S al E 1. Reducción de la Entropía 3. Compensa las distorsiones del S en ese momento 2. Romper la capa de solvatación que el S posee con el agua 4. Permitir la alineación correcta de los grupos funcionales catalíticos del E 24 8

9 1 E Entropía E Menor movimiento= mas orden= Entropía 2 Romper capa de solvatación 3 4 S E E E S I E E E Adaptación del S EI Compensa las distorsiones de S S Alineación eficaz de los E E grupos catalíticos para interaccionar con S Reducción de la Entropía Romper la capa de solvatación que el S posee con el agua 27 9

10 3. Distorsiones estructurales ó electrónicas del S en ese momento 28 Relación entre la E de fijación y la especificidad del E Especificidad: capacidad de una E para diferenciar entre dos sustratos competitivos > especificidad > Energía de fijación 29 Mecanismos catalíticos El S unido al E utiliza grupos funcionales distintos a los de fijación que intervienen rompiendo o formando enlaces. CATALISIS ACIDO-BASE CATALISIS COVALENTE CATALISIS POR IONES METÁLICOS CATALISIS ELECTROSTÁTICA EFECTO DE PROXIMIDAD Y ORIENTACIÓN FIJACIÓN PREFERENCIAL DEL ESTADO DE TRANSICIÓN 30 10

11 CATÁLISIS ACIDO-BASE Catálisis ácida: transferencia parcial de un protón desde un residuo de la enzima, que se comporta como un ácido de Bronsted (especie donadora de protones), al sustrato o intermediarios de la reacción, disminuyendose la E libre del estado de transición Catálisis básica: transferencia de un protón desde el sustrato o intermediarios de la reacción a un residuo de la enzima, que se comporta como una base de Bronsted (especie aceptora de protones), disminuyéndose así la energía libre del estado de transición. Catálisis ácido-base general concertada: simultáneamente se dan ambos procesos. Generalmente concertada. 31 CATÁLISIS ACIDO-BASE Transferencia de protones H 2 O donador H + ; H 3 O + ; - OH Cátalisis ácido-básica especifica Interm. inestable A + B P H 2 O H + ; H 3 O+ ; - OH Donadores o aceptores distintos al H 2 O Cátalisis ácido-básica general A + B Interm. inestable P Grupos dadores o aceptores de H + R de aa; aa; ácidos ó bases débiles Estos grupos se posicionan en el centro activo del E, permiten la transferencia de H + e incrementan la V de 10 2 a 10 5 veces 32 Ej: Catalisis ácido-base de la hidrólisis de RNA por la Ribonucleasa A de páncreas bovino Transparencia Voet cap

12 Mecanismo de RNAsa A Hidrólisis de RNA en dos pasos, con formación intermedia de un nucleótido 2, 3 - cíclico 1. His12 (base)quita un protón de un grupo 2 - OH de RNA. Promueve ataque nucleofílico al átomo de P adyacente. His119 promueve la escisión del enlace. 2. Eliminado el grupo, ingresa H 2 O en el sitio activo. El intermediario 2 3 -cíclico se hidroliza. His12 actúa como base e His119 como ácido general. RNA hidrolizado 34 Ej: Catálisis ácido-base de tautomerización ceto-enol Transparencia Voet cap R. No catalizada Muy lenta Se rompe el enlace C=O carbanión (C unido a O con carga -) El protón se desplaza hacia el O. Crea un = entre los dos C Existe un dador de protones al <E activacción del est.trans. Reduce su carácter de carbanión Existe un aceptor de protones al <E activacción del est.trans

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14 CATÁLISIS COVALENTE= Catálisis nucleofílica La E forma un enlace covalente transitorio con el S El ataque de un grupo nucleofílico (-) ó electrofílico (+) del centro activo del E Unión del S con el E = Intermedio ES Ej: E unidos a coenzimas, forman estos enlaces covalentes con el S Ej: Serin Proteasas Coenzimas : Pirofosfato de tiamina (TPP) Fosfato de piridoxal(plp) Actúan asociadas con sus apoenzimas como catalizadores covalentes 40 CATÁLISIS COVALENTE consiste en tres pasos sucesivos Ataque nucleofílico de la enzima sobre el sustrato (formación del enlace covalente). Toma de electrones por el catalizador u otro sustrato (formación del producto). Separación del producto de la enzima (ruptura del enlace covalente, generalmente por hidrólisis). E: H 2 O A B A E + B A + B + E E: enzima con grupo nucleofílico R-CO-NH-R + E- CH 2 OH R-COO-CH 2 -E + R -NH 2 Se, R-COO-CH 2 -E + H 2 O enlace ester entre el E y una parte del S hidrolisis recuperación del E R-COOH + E-CH 2 OH 41 CATÁLISIS COVALENTE El N protonado actúa como sumidero de e - intermedio covalente Amina como nucleófilo ataca al grupo carbonilo del acetoacetato para formar base de Schiff (enlace imino) 1.R. Nucleofílica entre E y S enlace covalente 2. Eliminación de e- por el E ahora electrofílico 3. Eliminación del E 42 14

15 Grupos nucleofílicos y electrofílicos de importancia biológica 43 Grupos nucleofílicos y electrofílicos de importancia biológica 44 CATÁLISIS POR IONES METÁLICOS Los metales pueden estar: - fuertemente unidos al E - captados de la solución junto con el S a) Estabilizando el estado de transición de la reacción Escudo de cargas negativas b) Facilitando una mejor orientación del S c) Facilitando reacciones de oxidoreducción mediante cambios reversibles en el ión metálico 45 15

16 CATÁLISIS POR IONES METÁLICOS 1. METALOENZIMAS: E y M después del proceso de purificación siguen unidos fuertemente ( Fe 2+ ; Fe 3+ ; Cu 2+ ; Zn 2+ ; Mn 2+ ; Co 2+ ) nunca darán E-S-M, pues E y M han de estar unidos 1. ENZIMAS ACTIVADAS POR METALES El metal participa en el proceso catalítico complejo ternario con el E y el S. Cuatro posibilidades E-S-M M-E-S E-M-S E M S 46 Ejemplos de metales usados como cofactores Cu +2 Fe +2 o Fe +3 K + Mg +2 Mn +2 Mo Ni +2 Se Zn +2 citocromo oxidasa catalasa, peroxidasa piruvato quinasa hexoquinasa arginasa dinitrogenasa ureasa glutation peroxidasa alcohol dehidrogenasa 47 CATÁLISIS POR IONES METÁLICOS 2.- ENZIMAS ACTIVADAS POR METALES E y M después del proceso de purificación siguen unidos débilmente, pero el E necesita su presencia para ser activo Los iones metálicos (ión cargado) pueden participar en cualquiera de los mecanismos citados (catálisis ácida, básica, covalente, aproximación y orientación de las moléculas que reaccionan, inducción de la configuración adecuada de la E, etc.) Ej: anhidrasa carbónica humana (ión Zn 2+ en centro activo ligado a 3 N de 3 His) (importancia en el control del equilibrio ácido-base del organismo) CO 2 + H 2 0 <---> H 2 CO 3 H 2 CO 3 <---> HCO 3- + H + Ac. carbónico 48 16

17 Quimotripsina Catálisis covalente y ácido- base general Rotura del enlace peptídico (S) Acilación del E Ser del centro activo forma enlace covalente con el S (catalisis covalente) His del centro activo, como base facilita la reacción (catalisis básica) 51 17

18 3. Formación del intermedio covalente acil-enzima Unión de H 2 O al intermedio covalente acil-enzima Desacetilación del intermedio covalente acíl-enzima 54 18

19 6. Formación del producto. Separación del enzima Liberación del producto. Recuperación del enzima 56 CATÁLISIS ELECTROSTÁTICA La enzima estabiliza intermediarios o estados de transición de la reacción por neutralización de cargas gracias a la disposición espacial en el sitio activo de residuos con carga opuesta. En otros casos la distribución de cargas en el sitio activo sirve para guiar a sustratos cargados o polares a sus sitios de unión. La exclusión de agua en el centro catalítico del E favorece la interacción entre especies cargadas 57 19

20 CATÁLISIS MEDIANTE EFECTOS DE PROXIMIDAD Y ORIENTACIÓN los sustratos quedan inmovilizados y alineados Efecto proximidad Efecto orientación -Aumenta su proximidad -Las moléculas reaccionan solo si encuentran la orientación relativa -Congela los movimientos adecuada translacionales -Incrementan la V de reacción en un -Congela los movimientos factor de 100 rotacionales -Disminución de entropía Aumento de reactividad entre moléculas Aumento de V de reacción 58 Proximidad favorable Orientación desfavorable Enzima Sustrato Proximidad desfavorable Orientación desfavorable Proximidad favorable Orientación favorable 59 CATÁLISIS POR FIJACIÓN DEL ESTADO DE TRANSICIÓN Uno de los mas importantes mecanismo del potro :el E tensionaria mecánicamente el S conformación del estado de transición El E fija y estabiliza el estado de transición mediante 2 enlaces de H V incrementa en 10 6 veces El estado de transición establece mejores contactos con el E que el propio sustrato 60 20

21 CATÁLISIS POR FIJACIÓN DEL ESTADO DE TRANSICIÓN En el estado de transición ES*, los enlaces químicos se encuentran en formación o rotura Liberación de energía que contribuye a v de reacción 61 21