FACULTAD DE QUÍMICA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA. CURSO DE BIOQUÍMICA (CLAVE 1508) Licenciaturas de QFB y QA

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1 FACULTAD DE QUÍMICA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA CURSO DE BIOQUÍMICA (CLAVE 1508) Licenciaturas de QFB y QA Prof. Laura Carmona Salazar Grupos: 03 Semestre: 13-I Este material es exclusivamente para uso educativo y no de lucro

2 ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LAS PROTEÍNAS 6. Funciones de las proteínas

3 UNA FUNCIÓN IMPORTANTE QUE PUEDEN DESEMPEÑAR LAS PROTEÍNAS ES LA CATÁLISIS DE LAS REACCIONES EN SISTEMAS BIOLÓGICOS: ENZIMAS

4 LA ACTIVIDAD CATALÍTICA DEPENDE DE LA INTEGRIDAD DE SU CONFORMACIÓN PROTEICA NATIVA ADEMÁS PUEDEN REQUERIR DE OTROS COMPONENTES QUÍMICOS ADICIONALES

5 CÓMO SON?

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7 QUIMOTRIPSINA LIBRE SITIO ACTIVO

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9 LOS ENZIMAS CATALIZAN REACCIONES DE MANERA EFICAZ Y ALTAMENTE ESPECÍFICA COMPLEJA ESTRUCTURACIÓN PROTEICA INTERACCIÓN PRECISA DEL ENZIMA-SUSTRATO ESPECIFICIDAD

10 INTERMEDIARIO TETRAHEDRICO DE VIDA CORTA ATAQUE NUCLEOFÍLICO SOBRE EL CARBONILO DEL ENLACE PEPTÍDICO

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13 SITIO ACTIVO

14 LAS PROTEASAS O PROTEINASAS O PEPTIDASAS ENZIMAS QUE ROMPEN ENLACES PEPTÍDICOS DE OTRAS PROTEÍNAS SERIN-PROTEASAS ZINC-PROTEASAS ASPARTIL-PROTEASAS CISTEIN-PROTEASAS ROMPEN EN SITIOS ESPECÍFICOS PROTEASAS DE SERINA Tienen prácticamente el mismo mecanismo catalítico Contienen la tríada catalítica: Ser, Asp, His TRIPSINA rompe después de una Arginina o Lisina QUIMOTRIPSINA rompe después de un aminoácido con R hidrofóbico SUBTILISINA rompe después de un aminoácido con un R pequeño no polar

15 MECANISMOS DE CATÁLISIS ENZIMÁTICA 1.- CATÁLISIS ÁCIDO BASE 2.- CATÁLISIS COVALENTE 3.- CATÁLISIS POR IONES METÁLICOS

16 AMINOÁCIDOS IMPLICADOS EN CÁTALISIS ÁCIDO-BASE GENERAL RESIDUO DE AMINOÁCIDO ÁCIDO GENERAL BASE GENERAL (DADOR DE H+) (ACEPTOR DE H+) CÁTALISIS COVALENTE AMINOÁCIDOS Y COFACTORES SIRVEN COMO NUCLEÓFILOS PARA FORMAR ENLACES COVALENTES TRANSITORIOS ENTRE EL ENZIMA Y EL SUSTRATO

17 ESTABILIZACIÓN DEL ESTADO DE TRANSICIÓN EN LAS PROTEASAS DE SERINA

18 CARBOXIPEPTIDASA A CATÁLISIS EL MECANISMO ES CONCERTADO (VARIOS FENÓMENOS SIMULTÁNEOS)

19 CARACTERÍSTICAS DEL SITIO CATALÍTICO O SITIO ACTIVO * Región tridimensional de la proteína * Es una región pequeña comparada con la magnitud total de la proteína Sitio activo o Sitio catalítico * Es una hendidura en la estructura de la enzima, localizada más o menos superficialmente en el cuerpo de la enzima * Une al sustrato específicamente, mediante un reconocimiento estructural complementario *Contiene a los grupos catalíticos y a los cofactores, si los hay *La interacción de éste, con el sustrato es no covalente, por tanto, es reversible * Es hidrofóbico, aunque puede tener a.a. polares y aún cargados * Tiene capacidad de orientar al sustrato

20 LAS ENZIMAS PUEDEN REQUERIR DE COFACTORES PARA SU ACTIVIDAD Uno o varios iones Inorgánicos COFACTOR Una molécula orgánica PEQUEÑA SE LLAMA COENZIMA UNIÓN FUERTE SE LLAMA GRUPO PROSTÉTICO

21 LAS COENZIMAS SE DERIVAN DE LAS VITAMINAS VITAMINA COENZIMA REACCIÓN EN LA QUE ESTÁ INVOLUCRADA Tiamina (vitamina B1) Tiamina pirofosfato Activación y transferencia de aldehídos Riboflavina (vitamina B2) Niacina Flavin mononucleótido o FMN; flavin adenin dinucleótido o FAD +, Nicotin amida adenin dinucleótido o NAD + ; Nicotin amida adenin dinucleótido fosfato o NADP + Oxidación-reducción Oxidación-reducción Ácido pantoténico Coenzima A Activación y transferencia de grupos acilo Piridoxina Fosfato de piridoxal Reacciones que involucran la activación de aminoácidos Biotina Biotina Activación y transferencia de CO2 Ácido lipoico Lipoamida Activación del grupo acilo:oxidaciónreducción Ácido fólico Tetrahidrofolato Activación y transferencia de grupos funcionales de un sólo carbono Vitamina B12 Adenosil cobalamina; metil cobalamina Isomerizaciones y transferencia de grupos metilo

22 ESTRUCTURA DE LAS COENZIMAS

23 ESTRUCTURA DE LAS COENZIMAS Biotina Pirofosfato de tiamina Ácido ascórbico

24 Nomenclatura de las enzimas a) Nombre común: sustrato o producto + terminación asa b) Nombre sistemático a) Reacción que cataliza b) Clase c) Subclase d) Número Tipos de enzimas según la reacción que catalizan: 1) Oxidoreductasas.- Reacciones redox que involucran transferencia de electrones 2) Transferasas.- Reacciones de transferencia de grupos funcionales 3) Hidrolasas.- Reacciones de hidrólisis 4) Liasas.- Crean dobles enlaces 5) Isomerasas.- Reacciones de isomerización 6) Ligasas.- Formación de puentes con rompimiento de ATP

25 QUÉ HACEN?

26 LAS ENZIMAS MODIFICAN LAS VELOCIDADES DE REACCIÓN PERO NO LOS EQUILIBRIOS LA ENERGÍA LIBRE (G) ES UNA FUNCIÓN TERMODINÁMICA QUE PERMITE COMPRENDER A LOS ENZIMAS DOS CONSIDERACIONES DE UNA REACCIÓN: 1) La diferencia de energía libre ( G) entre los productos y reactantes 2) La energía requerida para iniciar la conversión de los reactantes a productos

27 S P Estado de transición libre Energía Estado basal Estado basal DETERMINA LA ESPONTANEIDAD DE LA REACCIÓN Coordenada de reacción (cambios químicos)

28 EL G ENTRE REACTANTES Y PRODUCTOS INDICA EL EQUILIBRIO DE LA REACCIÓN LOS ENZIMAS ACELERAN ESTE PASO CÓMO LO HACEN?

29 libre Estado de transición S S P BARRERA ENERGÉTICA Energía libre de activación MÁS LENTA Energía Estado basal Estado basal Energía libre Coordenada de reacción (cambios químicos)

30 LOS ENZIMAS FACILITAN LA FORMACIÓN DEL ESTADO DE TRANSICIÓN (Proporcionando una superficie complementaria a su estereoquímica, polaridad o carga) Estado de transición S Energía libre Estado basal Estado basal Energía libre Coordenada de reacción (cambios químicos)

31 Las enzimas disminuyen la energía de activación de las reacciones que catalizan, pero no modifican la constante de equilibrio Por tanto aceleran en igual proporción la velocidad de la reacción en las dos direcciones AUMENTOS EN LA VELOCIDAD DE ENTRE 5 A 17 ÓRDENES DE MAGNITUD

32 CÓMO FACILITAN LOS ENZIMAS LA DISMINUCIÓN DE LA ENERGÍA LIBRE DE ACTIVACIÓN? FAVORECER LA FORMACIÓN DE ESTADOS DE TRANSICIÓN: 1) A TRAVÉS DE LA FORMACIÓN DE ENLACES COVALENTES DURANTE LA CATÁLISIS (ENTRE SUSTRATOS Y LAS CADENAS LATERALES DE CIERTOS RESIDUOS DE AMINOÁCIDOS, IONES METÁLICOS Y COENZIMAS) 2) POR MEDIO DE INTERACCIONES NO COVALENTES ENTRE EL ENZIMA Y EL SUSTRATO ENERGÍA DE FIJACIÓN Es aquella energía proveniente de la interacción enzima-sustrato

33 ENERGÍA DE FIJACIÓN PERMITE: LA ESPECIFICIDAD Y LA CATÁLISIS LAS INTERACCIONES DÉBILES ESTÁN OPTIMIZADAS EN EL ESTADO DE TRANSICIÓN EL SITIO CATALÍTICO DE LOS ENZIMAS SON COMPLEMENTARIOS NO A LOS SUSTRATOS per se SINO A LOS ESTADOS DE TRANSICIÓN EN QUE PARTE DEL ENZIMA SUCEDE ESTO?

34 MODELO DE LA LLAVE-CERRADURA

35 Modelo de la llave cerradura (Fisher) Substrato + a b c a b c Enzima Complejo [enzima - sustrato] Modelo del guante mano (Koshland) o Modelo de ajuste inducido Sustrato + a a b c b c Enzima Complejo [enzima - sustrato] MODELOS DE RECONOCIMIENTO ENZIMA - SUSTRATO

36 MODELO DEL AJUSTE INDUCIDO Postulado por Daniel Koshland en 1958 Disminución de los movimientos de los sustratos que reaccionan REDUCCCIÓN DE LA ENTROPÍA La formación de enlaces débiles enzima-sustrato da lugar a la DESOLVATACIÓN DEL SUSTRATO (las interacciones reemplazan los puentes de hidrógeno que existan entre el sustrato y el agua en disolución) CAMBIO CONFORMACIONAL del enzima cuando se fija el sustrato

37 FACTORES FÍSICOS O FISICOQUÍMICOS QUE PUEDEN AFECTAR LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 1. ph 2. TEMPERATURA 3. FUERZA IÓNICA 4. CONSTANTE DIELÉCTRICA DEL MEDIO

38 Efecto de la temperatura en la actividad enzimática Actividad de la enzima Temperatura óptima 20º C 30º C 60ºC

39 Efecto del ph en la actividad enzimática ph óptimo A C T I V I D A D Tripsina Colinesterasa Pepsina Papaína ph 8 ph ph 5 8 ph

40 E + S ES E + P Sustrato [Enzima-sustrato] Sitio activo Sitio activo + Producto Enzima

41 CINÉTICA ENZIMÁTICA.- Disciplina que se encarga de estudiar el mecanismo de una reacción catalizada enzimáticamente. OBJETIVO.- Determinar la velocidad de la reacción y evaluar como se ve modificada ésta en respuesta a cambios en los parámetros experimentales VELOCIDAD= Cantidad de sustrato desaparecido o producto formado por la enzima por unidad de tiempo Por tanto sus unidades son cantidad de compuesto sobre unidad de tiempo: moles µmoles nmoles gramos miligramos µgramos hora minuto segundo

42 S P E + S ES E + P ESTADO PRE-ESTACIONARIO 1) ESTADO PRE-ESTACIONARIO = HAY EXCESO DE SUSTRATO Y AUMENTA LA CONCENTRACIÓN DE ES (ES RÁPIDO, DURA MICROSEGUNDOS) 2) ESTADO ESTACIONARIO = LA CONCENTRACIÓN ENZIMA-SUSTRATO PERMANECE APROX. CONSTANTE

43 MODELO DE Leonor MICHAELIS -Maud MENTEN k 1 k E + S [ES] 2 E + P 1 K -1 Relaciona velocidad de la reacción con [S] y [E] V o = k 2 [ES] 2 o 2 Queremos saber cuánto ES se forma Velocidad de formación de ES = k 1 [E][S] 3 Velocidad de desaparición de ES = (k -1 + k 2 ) [ES] 4

44 En el estado estacionario, las velocidades de formación y desaparición de [ES] son iguales, donde [ES] es constante, mientras que [Reactivos] y [Productos] cambian k 1 [E] [S] = (k 2 + k 3 ) [ES] 5 [ES] = [E] [S] (k 2 + k 3 )/k 1 6 Definimos una nueva constante: (para el denominador) Km = constante de Michaelis Km = k 2 + k 3 k 1 7 Sustituimos en 6 Km es independiente de la concentración del enzima y la de sustrato [ES] = [E] [S] Km 8

45 Asumiendo que ponemos un gran exceso de S con respecto a E, entonces [S] va a ser teóricamente la inicial o sea el total de [S]. Con respecto a [E], ésta se va a estar combinando con él. Va haber también E libre. [E] = [E total ] - [ES] 9 Sustituyendo para [E] en 8 [ES] = ([E total ] - [ES] ) [S] Km 10 [ES] = [E t ] [S] / Km 1 + [S] / Km 11 [ES] = [E t ] [S] [S] + Km 12 V o = k 2 [ES]

46 V = k 2 [E t ] [S] [S] + Km 13 Ya que la velocidad máxima (Vmax) se alcanza cuando los sitios de la enzima están saturados con sustratos, o sea cuando [S] >> Km, y entonces [S] Se aproxima a 1 [S] + Km entonces Vmax = k 2 [E t ] 14 Km = [S] a la cual la velocidad de la reacción tiene la mitad de su valor máximo sustituyendo 14 en 13 V = Vmax [S] [S] + Km

47 VELOCIDAD DE LA REAC CCIÓN Concentración del sustrato V = Vmax [S] [S] + Km

48 GRÁFICA DE DOBLES RECÍPROCOS O DE LINEWEAVER-BURK (TRANSFORMACIÓN DE LA ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN) V o = V max [S] INVERSO 1 = K m + [S] [S] + K m V max [S] V o 1 = K m + [S] V o V max [S] V max [S] Pendiente 1 = K m + 1 V o V max [S] V max Ecuación de Lineweaver-Burk